軟脂酸誘導血管內(nèi)皮細胞Toll樣受體4表達.pdf

1、目的:研究飽和脂肪酸（Saturated fatty acids，SFAs）軟脂酸(Palmitate，PA)對血管內(nèi)皮細胞(Vascular endothelial cells)Toll樣受體4 mRNA及其蛋白表達的影響，探討軟脂酸刺激下TLR4對內(nèi)皮細胞分泌IL-6和腫瘤壞死因子α的影響，探討代謝綜合征(metabolic syndrome，MS)患者內(nèi)皮細胞胰島素抵抗的發(fā)病機制。
　　 方法:培養(yǎng)豬髖動脈內(nèi)皮細胞(Pig

2、 Iliac Endothelial Cells， PIECs)，將培養(yǎng)的細胞分為實驗組和對照組。在實驗組加入含不同濃度(100μmol/l、200μmol/l)軟脂酸的培養(yǎng)基，在對照組加入不含軟脂酸的培養(yǎng)基進行培養(yǎng)。①各組細胞在相同條件下分別培養(yǎng)6h、12h、24h，采用實時熒光定PCR(quantitative real-time PCR)檢測PIECs TLR4 mRNA表達，并通過此實驗確定軟脂酸誘導TLR4表達的最適濃度和最適

3、作用時間;②各組細胞在相同條件下培養(yǎng)12h，蛋白印跡法(westernblotting)檢測PIECs TLR4蛋白表達;③各組細胞在相同條件下培養(yǎng)12h，流式細胞術(shù)(flow cytometry)檢測PIECs細胞表面TLR4蛋白水平;④選用200μ mol/l軟脂酸孵育PIECs，用酶聯(lián)免疫吸附試驗分別檢測軟脂酸刺激前及刺激6h、12h、24h后細胞上清液中IL-6和TNF-α的表達情況。
　　 結(jié)果:
　　 1.實

4、時熒光定量PCR檢測結(jié)果:在100μM軟脂酸組PIECs在孵育6h后TLR4mRNA表達開始增加，但與對照組比較差異無顯著性(P＞0.05);在12h后PIECsTLR4 mRNA的表達達最高峰，與6h及對照組比較差異有顯著性(P＜0.05);在24h時，TLR4 mRNA表達比12h的表達降低(P＜0.05)，但較對照組及6h差異有顯著性(P＜0.05)。200μM軟脂酸組與100μM軟脂酸組規(guī)律基本相同，但PIECs在孵育6h后TL

5、R4 mRNA表達開始增加，與對照組比較差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。200μM軟脂酸組均較同時間點100μM軟脂酸組TLR4 mRNA表達增加，差異有顯著性(P＜0.05)。各時間點對照組之間TLR4 mRNA表達無顯著性(P＞0.05)。
　　 2.蛋白印跡法檢測結(jié)果:100μM、200μM軟脂酸分別刺激PIECs12小時后TLR4蛋白表達顯著升高，與對照組比較，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05);而100μM軟脂酸組TL

6、R4蛋白的表達又低于200μM軟脂酸組，兩組比較，差異具顯著性(P＜0.05)。
　　 3.流式細胞術(shù)檢測結(jié)果:軟脂酸組PIECs在100μM、200μM軟脂酸分別孵育12h后細胞膜TLR4蛋白水平較對照組顯著增加，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05);200μM軟脂酸組TLR4蛋白的表達又高于100μM軟脂酸組，兩組比較，差異具顯著性(P＜0.05)。
　　 4.ELISA檢測結(jié)果:與對照組相比，軟脂酸組PIECs在200

7、μM軟脂酸孵育6h后，細胞上清液中IL-6和TNF-α分泌量即顯著增加(P＜0.05)。在孵育12 h后，IL-6和TNF-α的水平隨孵育時間的延長而呈上升趨勢，在24 h最高(P＜0.05)。
　　 結(jié)論:
　　 1.軟脂酸可使豬髖動脈內(nèi)皮細胞TLR4蛋白及mRNA的表達上調(diào)。在本實驗條件下，內(nèi)皮細胞TLR4 mRNA的表達水平在12h后呈下降趨勢，可能與軟脂酸的長期作用使細胞毒性作用增強，進一步導致細胞內(nèi)蛋白質(zhì)及DN