RgsA在銅綠假單胞菌抗氧化應(yīng)激中的作用.pdf

1、目的:
　　銅綠假單胞菌是臨床上極為常見(jiàn)的條件致病菌,患代謝性疾病、血液病和惡性腫瘤的患者,以及術(shù)后或某些治療后的患者易感染本菌,具有多重耐藥的特點(diǎn)。尋找銅綠假單胞菌通過(guò)何種途徑感知外界的變化,以何種方式改變生理學(xué)過(guò)程從而適應(yīng)環(huán)境,一直是該菌的研究熱點(diǎn)之一。
　　細(xì)菌小RNA(small regulatory RNA)是細(xì)菌中普遍存在的一類長(zhǎng)度在40~500個(gè)核苷酸的,具有調(diào)控功能的小分子RNA,簡(jiǎn)稱為sRNA(small

2、RNA),sRNA在廣泛細(xì)菌種群的許多關(guān)鍵生命進(jìn)程中發(fā)揮重要的調(diào)控作用,其調(diào)控作用在數(shù)量上和多樣性上甚至超過(guò)了蛋白質(zhì)。迄今已在銅綠假單胞菌中發(fā)現(xiàn)29種sRNA,其中RgsA是由NicolasGonzález在2008年進(jìn)行全基因組搜索發(fā)現(xiàn)的,存在于銅綠假單胞菌和熒光假單胞菌中的sRNA,推測(cè)可能與銅綠假單胞菌抗氧化應(yīng)激反應(yīng)有關(guān),在銅綠假單胞菌生物膜狀態(tài)下高度表達(dá)。銅綠假單胞菌難治性持續(xù)性感染與生物膜形成聯(lián)系密切。在人類感染性疾病中,約有

3、65％與生物膜有關(guān),例如牙菌斑、囊性纖維化肺病、反復(fù)發(fā)作的慢性中耳炎、慢性骨髓炎、慢性鼻竇炎及慢性傷口感染等。對(duì)本研究擬從sRNARgsA的基本結(jié)構(gòu)、功能、作用機(jī)制到調(diào)控方式進(jìn)行深入研究,以探討該sRNA在銅綠假單胞菌生命活動(dòng)中的作用。
　　方法:
　　(1)本研究以銅綠假單胞菌PAO1菌株作為實(shí)驗(yàn)菌株,根據(jù)公用數(shù)據(jù)庫(kù)的序列信息和文獻(xiàn)資料設(shè)計(jì)合成引物,采用5′RACE確定轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn),結(jié)合Northernblot與計(jì)算機(jī)預(yù)測(cè)

4、3′末端轉(zhuǎn)錄終止序列,以確定RgsA的基本轉(zhuǎn)錄本結(jié)構(gòu)。
　　(2)在此基礎(chǔ)上,PCR擴(kuò)增rgsA同源臂與慶大霉素抗性基因插入自殺質(zhì)粒pEX18-Ap,構(gòu)建rgsA基因敲除載體,利用雙親雜交轉(zhuǎn)化銅綠假單胞菌PAO1,構(gòu)建rgsA基因缺陷株SH2-5。
　　(3)PCR擴(kuò)增rgsA基因編碼片段,插入pJN105質(zhì)粒阿拉伯糖誘導(dǎo)型啟動(dòng)子的下游,構(gòu)建rgsA基因表達(dá)載體,轉(zhuǎn)化rgsA基因缺失缺陷株SH2-5,構(gòu)建rgsA基因補(bǔ)償/過(guò)

5、表達(dá)株。
　　(3)以生長(zhǎng)時(shí)間為橫坐標(biāo),OD600值為縱坐標(biāo)繪制生長(zhǎng)曲線,觀察野生株、rgsA基因缺陷株的生長(zhǎng)情況。
　　(4)利用Trizol法分別抽提不同濃度過(guò)氧化氫,有機(jī)過(guò)氧化物刺激下銅綠假單胞菌的總RNA,Real-timePCR檢測(cè)RgsA表達(dá)情況。
　　(5)以含有不同濃度過(guò)氧化氫,有機(jī)過(guò)氧化物L(fēng)B平板作為培養(yǎng)基進(jìn)行平板實(shí)驗(yàn),以不同濃度過(guò)氧化氫與不同反應(yīng)時(shí)間組合,進(jìn)行MTT實(shí)驗(yàn),比較野生株,缺失株以及過(guò)表達(dá)

6、菌株在浮游菌狀態(tài)下抗氧化應(yīng)激能力。
　　(6)野生株,缺失株以及過(guò)表達(dá)菌株分別進(jìn)行生物膜培養(yǎng),三天后利用不同濃度過(guò)氧化氫分別對(duì)形成的生物膜進(jìn)行刺激,SYTO9/PI染色后熒光顯微鏡觀察,以比較三者間在生物膜狀態(tài)下抗氧化應(yīng)激能力。
　　結(jié)果:
　　(1)rgsA在銅綠假單胞菌中存在兩個(gè)轉(zhuǎn)錄本,轉(zhuǎn)錄本長(zhǎng)度分別約為300bp與90bp。其中短片段轉(zhuǎn)錄本的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn),位于NCBI注釋基因片段起始下游86bp處,長(zhǎng)片段轉(zhuǎn)錄本的

7、轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn),位于NCBI注釋基因片段起始上游157bp處。
　　(2)經(jīng)PCR及測(cè)序證明,銅綠假單胞菌缺陷株SH2-5中缺失rgsA基因,成功構(gòu)建銅綠假單胞菌rgsA基因缺陷株。經(jīng)測(cè)序證明,過(guò)表達(dá)質(zhì)粒pJN105-SH和補(bǔ)償/過(guò)表達(dá)菌株SH2S構(gòu)建的正確性。
　　(3)生長(zhǎng)曲線提示rgsA基因缺陷株生長(zhǎng)速度明顯低于野生株。
　　(4)經(jīng)Real-timePCR檢測(cè),不同濃度過(guò)氧化氫以及有機(jī)過(guò)氧化物刺激下,RgsA表達(dá)

8、均有不同程度的增加,尤其在有機(jī)過(guò)氧化物刺激時(shí)表達(dá)明顯上升。
　　(5)通過(guò)計(jì)算生長(zhǎng)于含有不同濃度過(guò)氧化氫與有機(jī)過(guò)氧化物的LB平板上的菌落數(shù),以及MTT法檢測(cè)各實(shí)驗(yàn)組中細(xì)菌總體活性,rgsA基因缺陷株表現(xiàn)出對(duì)過(guò)氧化氫及有機(jī)過(guò)氧化物的抵抗能力明顯下降,而在突變菌株中導(dǎo)入表達(dá)載體后,在0.1%L-Arabinose的誘導(dǎo)下,對(duì)氧化應(yīng)激的抵抗能力恢復(fù)到接近野生株的水平。
　　(6)野生株,缺失株,過(guò)表達(dá)株在流動(dòng)培養(yǎng)系統(tǒng)中培養(yǎng)3天后形