PA0861在銅綠假單胞菌PAO1中作用的研究.pdf

1、目的：探討銅綠假單胞菌PAO1中GGDEF-EAL結構域蛋白質PA0861的生物學功能，并分析環(huán)二鳥苷酸（C-di-GMP）與銅綠假單胞菌鐵的吸收之間的關系，以期在未來加深對銅綠假單胞菌致慢性感染的相關原因的理解。
　　方法：從Manoil實驗室得到了PA0861轉座子突變體菌株和PAO1野生型菌株。首先采用聚合酶鏈反應（Polymerase Chain Reaction PCR）方法來確認基因PA0861的突變位點。之后經(jīng)表型分

2、析，比較突變體及野生型銅綠假單胞菌生物膜的變化。利用Microarray比較PA0861突變體菌株和PAO1野生型菌株的基因表達譜。Microarray數(shù)據(jù)首先通過GO分析基因表達的相關數(shù)據(jù)，運用WEGO對突變體PA0861和野生型PAO1中表達不同的基因進行對比分析。然后運用KEGG和DAVID對PA0861可能影響的信號轉導通路進行分析，比較銅綠假單胞菌中鐵載體合成的一系列基因，利用半定量逆轉錄聚合酶鏈反應分析PA0861對調控鐵載

3、體合成的影響，比色法和薄層層析色譜在基因產物的水平來驗證兩個菌株鐵載體水平，從而初步分析基因PA0861是如何影響銅綠假單胞菌鐵的吸收，以及推斷c-di-GMP來調節(jié)銅綠假單胞菌鐵載體的生物學作用。
　　結果：
　　1.通過PCR反應結果經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳得到的結果來看，A2與C2得到了明亮清晰的條帶，A2與C2的模板都是突變體PA0861，而其它樣品沒有條帶，從而可以得出由于轉座子的插入位點在PA0861基因上，從而導致其失

4、活。
　　2.對菌株突變體 PA0861和野生型 PAO1進行表型對比分析，通過結晶紫染色生物膜定量實驗，在 LB液體培養(yǎng)基中生長4、8、12小時的兩個菌株，統(tǒng)計得出突變體PA0861形成的生物膜在各個時間點都比野生型PAO1生成的多，均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。
　　3. Microarray分析銅綠假單胞菌整個基因表達譜，分析以后發(fā)現(xiàn)在突變體PA0861和野生型PAO1的比較中有2782個基因在轉錄水平上發(fā)生改變，其

5、中大約有2400個基因mRNA上調382個基因下調達兩倍以上。由于上調的基因比下調基因多很多，我們校正標準，選擇的標準為 PA0861上調達到6倍和下調達到2.5倍才計為差異表達。FDR<5％，SAM在0.05（P＜0.05）。結果分析導致上調的基因是319個，下調的基因為198個。
　　1）通過GO分析全面比較在突變體PA0861和野生型PAO1中表達譜，初步發(fā)現(xiàn)在這517個發(fā)生變化的轉錄子中，顯著性不同的有215個，占了調節(jié)銅

6、綠假單胞菌的生物學過程42%。
　　2）利用WEGO分析突變體PA0861的生物學功能的時候，發(fā)現(xiàn)涉及到色素的基因有26個。
　　3）利用KEGG進行通路分析，在P＜0.05的情況下，除了涉及到核酸合成，細胞周期，能量產生等以外，最突出的在突變體 PA0861中，鐵載體生物合成的基因，有5個基因被激活。
　　4.銅綠假單胞菌中有兩個主要的鐵載體，假單胞菌素（Pyoverdine)和銅綠假單胞菌螯鐵蛋白（Pyocheli

7、n)。利用KEGG通路分析時，發(fā)現(xiàn)最突出的是突變體PA0861中五個與鐵載體生物合成的基因被激活。調控Pyoverdine合成的基因位于PAO1基因組，橫跨約120kb的區(qū)段，約70個基因。我們從中挑選了11個基因，分別代表上調2倍到19倍，然后通過以GAPDH為內參，用半定量RT-PCR的方法進行mRNA水平的比較，結果是PA2385，PA2392，PA2394，PA2395，PA2398，PA2403，PA2443，PvdS的表達是

8、上調，PA2388和PA2418是下調，PA2444在突變體PA0861和野生型PAO1中沒有變化。對于Pyochelin，在突變體PA0861中，所有基因都上調，倍數(shù)在3.86-14倍之間。總體上大多數(shù)基因是上調的，只有少數(shù)減少和沒變化。
　　5.進一步對Pyochelin運用TLC的方法進行半定量的比較分析，以水楊酸為標準品，并以具有 PDE活性的 RocR，有 DGC活性的 WspR作對照。從結果可以看出突變體PA0861生

9、成的Pyochelin比PAO1生成的多，與ROCR突變體合成的相近。
　　6.通過對菌株突變株PA0861和野生型PAO1中Pyoverdine，用比色法作定量分析，得到在6小時和18小時，突變體PA0861中Pyoverdine的產量都比野生型PAO1的多，均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。說明基因PA0861可能調控鐵載體的生物合成，從而也調控銅綠假單胞菌生物膜的合成。
　　結論：我們已經(jīng)知道PA0861基因涉及c-di

10、-GMP的合成與分解，并影響生物膜的形成。為了進一步了解PA0861基因是通過怎樣的分子機制來影響生物膜，首先通過在轉錄的水平上對其進行分析，發(fā)現(xiàn)基因 PA0861的失活使涉及鐵載體 Pyoverdine和Pyochelin合成的基因絕大多數(shù)發(fā)生了上調，說明基因PA0861可能影響對銅綠假單胞菌的鐵載體形成，由此影響了生物膜的形成，其趨勢與我們先前對基因PA0861進行生物學表型分析的結果一致。由此的初步結論是基因PA0861調節(jié)銅綠假