銅綠假單胞菌與慶大霉素抗性相關(guān)的PA5471-PA5472基因間隔區(qū)調(diào)控功能研究.pdf

1、銅綠假單胞菌是一種重要的條件致病菌，在臨床上常常引起難治性和頑固性感染。隨著廣譜抗生素藥物的廣泛大量使用，該菌的多重耐藥現(xiàn)象和發(fā)生頻率呈現(xiàn)上升趨勢。在銅綠假單胞菌基因組中，有一部分基因間隔區(qū)序列，雖然不能編碼蛋白質(zhì)產(chǎn)物，但能夠與特定的蛋白質(zhì)結(jié)合，或是具有啟動子活性，通過近端或遠端調(diào)控甚至參與到復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)而調(diào)節(jié)某些基因的功能。研究與耐藥性密切相關(guān)的基因間隔區(qū)調(diào)控功能，將作為另一個有效的突破口，對于解釋銅綠假單胞菌復(fù)雜的多重耐藥機制有重

2、要意義。
　　 本文以一株卡那霉素敏感的臨床分離株P(guān)A68為出發(fā)菌株，應(yīng)用人工Mu轉(zhuǎn)座技術(shù)構(gòu)建突變文庫并從中篩選得到一株對慶大霉素抗性明顯增強的菌株C18。突變株通過基因克隆、核苷酸序列分析，確定在基因組上的Mu插入位點為PA5471-PA5472之間的基因間隔區(qū)。該基因間隔區(qū)的上下游基因PA5471和PA5472均屬Ⅳ類基因。
　　 通過生物信息學分析，該基因間隔區(qū)內(nèi)含有假定的啟動子序列，因此構(gòu)建野生型和Mu插入突變型

3、基因間隔區(qū)的啟動子-報告基因融合質(zhì)粒，并在銅綠假單胞菌PA68中進行表達。報告基因產(chǎn)物β-半乳糖苷酶活性分析結(jié)果顯示，野生型和突變型的基因間隔區(qū)均有轉(zhuǎn)錄活性，并且Mu插入突變后該間隔區(qū)的轉(zhuǎn)錄活性明顯增強。
　　 本文首次利用Mu體外突變產(chǎn)生系統(tǒng)對具有啟動活性的基因間隔區(qū)進行功能研究，構(gòu)建了一系列的該間隔區(qū)序列的15 bp隨機插入庫，并對啟動子.報告基因融合質(zhì)粒的β-半乳糖苷酶活性進行詳細分析。實驗結(jié)果表明：該間隔區(qū)內(nèi)不同位置的序