腫瘤相關(guān)K-ras基因熱點突變檢測方法及血游離DNA標本分析.pdf

1、目的:利用高保真聚合酶介導(dǎo)的突變敏感性分子開關(guān)結(jié)合實時熒光定量PCR技術(shù)，建立對K-ras基因7個熱點突變同時進行快速篩查的技術(shù)平臺，采用多重PCR和單重PCR相結(jié)合，通過擴增曲線和熔解曲線判斷7個熱點突變的存在與否，并可以對突變進行半定量分析。檢測K-ras基因相關(guān)突變的有無，可用于對腫瘤的發(fā)生進行預(yù)測，指導(dǎo)腸癌以及其他腫瘤患者的合理用藥并對腫瘤進行預(yù)后分析。
　　 方法:將包括K-ras基因12，13號密碼子在內(nèi)的PCR產(chǎn)物

2、克隆至PGEM-T載體，通過LB/Amp平板篩選陽性克隆，挑選菌落進行培養(yǎng)并提取質(zhì)粒DNA。對質(zhì)粒DNA進行PCR擴增初步確定陽性克隆并通過測序分析得到確證，獲得K-ras基因野生型質(zhì)粒模板。采用重疊延伸定點突變技術(shù)，得到了7種突變基因型PCR產(chǎn)物，將此7種PCR產(chǎn)物與PGEM-T載體相連接，再次轉(zhuǎn)化E.coli JM109感受態(tài)細胞，篩選陽性克隆，測序鑒定得到K-ras基因7種熱點突變的質(zhì)粒模板。進一步設(shè)計與K-ras基因7個熱點突變

3、配對的3’末端硫化修飾正向引物，并在其下游設(shè)計一條公共反向引物，同時設(shè)計與野生型基因模板相配對的分子開關(guān)檢測引物，分別構(gòu)成特異性突變檢測引物與特異性野生檢測引物。對K-ras基因野生型質(zhì)粒模板和7種突變型質(zhì)粒模板，進行高保真DNA聚合酶介導(dǎo)的突變敏感性分子開關(guān)檢測，結(jié)合熒光定量PCR技術(shù)對7對突變檢測引物的檢測特異性及敏感性進行分析并優(yōu)化單重PCR及多重PCR的反應(yīng)條件。采集正常人以及腫瘤患者的組織或血樣標本，通過臨床樣本對檢測方法進行

4、評估，并對腫瘤樣本進行k-ras基因7個熱點突變的篩查。
　　 結(jié)果:在一定的反應(yīng)條件及反應(yīng)體系下，特異性野生檢測引物與野生模板配對得以延伸;而與突變模板不配對則不能延伸。當特異性突變檢測引物與突變模板配對，引物得以延伸;而與野生模板不配對則不能延伸。突變敏感性分子開關(guān)技術(shù)對20例正常人的基因組DNA以及1份含有200例正常人基因組的DNA池標本進行檢測，特異性突變檢測引物無一例有擴增產(chǎn)物，而特異性野生引物均有擴增產(chǎn)物，與測序結(jié)

5、果一致，證實此“分子開關(guān)”技術(shù)的檢測特異性高。突變敏感性分子開關(guān)對15例肺癌組織DNA標本進行篩查，5例經(jīng)特異性突變檢測引物擴增后有目的產(chǎn)物;從14例腫瘤患者血漿中提取的游離DNA樣本，經(jīng)特異性突變檢測引物擴增后3例有目的產(chǎn)物，以上腫瘤標本的檢測結(jié)果與測序結(jié)果一致。由此可以看出，突變敏感分子開關(guān)對體細胞突變的檢測具有很好的特異性及敏感性。
　　 結(jié)論:高保真酶介導(dǎo)的突變敏感性分子開關(guān)可用于已知基因突變的檢測，除可用于檢測外周血白