穩(wěn)定分化軟骨前體細胞株的建立與鑒定及其NMR波譜和材料相容性研究.pdf

1、本文旨在建立分離培養(yǎng)和鑒定大鼠骨骺生長板軟骨細胞亞群的實驗方法，探討其靜止區(qū)軟骨細胞的生物學(xué)特性；并通過基因工程技術(shù)，誘導(dǎo)靜止區(qū)骺軟骨細胞穩(wěn)定分化，篩選穩(wěn)定分化株，研究其基因和蛋白質(zhì)表達，監(jiān)測細胞表面的代謝變化和細胞內(nèi)離子濃度，全面評估其遺傳特征保存情況；分析穩(wěn)定分化軟骨前體細胞與納米組織工程材料的復(fù)合黏附特性及其增殖分化的變化。本課題深入研究骨骺軟骨細胞增殖、分化規(guī)律，為人工調(diào)控骨與軟骨的生長和通過現(xiàn)代組織工程技術(shù)修復(fù)軟骨的研究建立實

2、驗基礎(chǔ)。 通過顯微外科技術(shù)解剖大鼠長骨骨骺生長板軟骨，酶消化法獲得分散的單細胞懸液；采用percoll不連續(xù)密度梯度離心法分離生長板細胞亞群，分層培養(yǎng)、觀察不同層細胞形態(tài)，并進行細胞生長動力學(xué)分析，電子顯微鏡觀察細胞超微結(jié)構(gòu)，組織化學(xué)和免疫細胞化學(xué)方法檢測不同細胞FGFR-3、X和Ⅱ型膠原的表達。利用獲得的骨骺生長板增殖區(qū)軟骨細胞亞群，提取總RNA，RT-PCR方法獲得PTHrp基因的全長cDNA，擴增后經(jīng)純化、雙酶切連接到真核

3、表達載體pEGFP-IRES2；轉(zhuǎn)化擴增后提取重組質(zhì)粒pEGFP-IRES2-PTHrp，進行酶切鑒定和序列測定。利用脂質(zhì)體介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)染技術(shù)將含有PTHrp基因的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至原代培養(yǎng)的新生大鼠軟骨前體細胞，經(jīng)G418篩選，抗性克隆擴大培養(yǎng)傳代。應(yīng)用FGFR-3、Ⅱ型膠原、X型膠原和PTHrp抗體進行免疫細胞化學(xué)鑒定，檢測其表型及分化能力，觀察細胞的形態(tài)及其生長狀況，繪制細胞生長曲線。用RT-PCR、Southernblot和west

4、emblot從不同層次鑒定PTHrp基因在轉(zhuǎn)染細胞中的表達。以重水(D2O)緩沖液重懸傳代培養(yǎng)的穩(wěn)定分化軟骨前體細胞，在灌流條件下，利用inova600型液態(tài)核磁共振譜儀測定細胞的31P-NMR波譜，和細胞內(nèi)游離Mg2+濃度，觀察波譜組成及各波峰高度，評價細胞代謝情況。嘗試細胞與nanoHA/PDLLA多孔材料復(fù)合培養(yǎng)7天后，進行形態(tài)學(xué)觀察和掃描電鏡觀察及MTT測定，了解細胞增殖及黏附情況，獲得了穩(wěn)定分化骨骺干細胞與組織工程材料的相容性

5、、黏附性的初步資料。 我們獲得了四層生長板軟骨細胞亞群，細胞活性達到了95％以上；原代培養(yǎng)細胞呈多角形，第8代細胞仍保持多角的形態(tài)；前4代細胞的每日倍增指數(shù)隨著傳代次數(shù)的增加而增加，第8代后顯著降低。依照細胞成熟程度，體積逐漸增大，密度逐層減?。卉浌乔绑w細胞表面有FGFR-3的表達，其他層細胞均為陰性；隨著細胞的逐漸成熟，Ⅱ型膠原表達逐漸減弱，而X型膠原的表達逐漸增強；隨著傳代次數(shù)增加陽性細胞的比例下降。從增殖區(qū)細胞提取的總RN

6、A純度、含量均符合要求，RT-PCR和PCR產(chǎn)物電泳可在預(yù)期大小處得到清晰條帶，酶切、連接、轉(zhuǎn)化后獲得2株陽性轉(zhuǎn)化大腸桿菌，大提產(chǎn)物經(jīng)限制性內(nèi)切酶酶切圖譜分析可得到目的基因條帶和載體條帶，DNA序列測定證實目的基因已插入重組質(zhì)粒。將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入軟骨前體細胞后獲得1個陽性細胞克隆，免疫細胞化學(xué)證實為具有較強增值能力和多分化潛能。經(jīng)Southem印跡雜交和Western證實，PTHrp已穩(wěn)定轉(zhuǎn)染入軟骨前體細胞，表達其mRNA及其蛋白。轉(zhuǎn)染

7、細胞經(jīng)擴大培養(yǎng)，命名為穩(wěn)定分化軟骨前體細胞(immortalizedprecartilaginousstemcell，IPSC)。貼壁培養(yǎng)的IPSC，群體倍增時間為22.92h，傳代、凍存和復(fù)蘇對細胞形態(tài)及生長無明顯影響。本實驗成功獲得穩(wěn)定分化軟骨前體細胞株31p-NMR波譜，發(fā)現(xiàn)其由PCr、ATP、Pi等五個共振峰組成，細胞內(nèi)游離Mg2+濃度為0.326mmol/L。穩(wěn)定分化軟骨前體細胞與nanoHA/PDLLA多孔材料具有良好的相容

8、性，細胞在材料上生長良好，材料對細胞增殖無不良影響，為進一步應(yīng)用研究研究打下基礎(chǔ)。 通過上述研究，我們發(fā)現(xiàn)能夠通過密度梯度離心法分離骨骺生長板細胞亞群，并可以獲得四個高純度、高活性的軟骨細胞亞群。第4代以前細胞表型穩(wěn)定，可以作為研究軟骨增殖分化調(diào)控的細胞平臺。從骨骺生長板增殖區(qū)軟骨細胞亞群中克隆PTHrp基因構(gòu)建其真核表達載體，可誘導(dǎo)軟骨前體細胞穩(wěn)定分化。穩(wěn)定分化軟骨前體細胞的31P-NMR波譜形態(tài)正常，代謝正常，內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定；細

9、胞與nanoHA/PDLLA多孔材料相容性良好，黏附能力強。本實驗所獲得的穩(wěn)定分化軟骨前體細胞株為骺軟骨細胞的實驗研究及其介導(dǎo)的細胞移植治療提供了穩(wěn)定的細胞來源。為進一步揭示PTHrp的生物學(xué)功能及其在在軟骨細胞的分化和骨骼形態(tài)發(fā)生中的作用奠定了良好的基礎(chǔ)，可望成為一種新的治療手段。 第一章骨骺細胞亞群的分離鑒定和生物學(xué)性狀研究 目的：分離培養(yǎng)并鑒定大鼠骨骺生長板軟骨細胞亞群，探討各亞群生物學(xué)特性，為研究軟骨細胞增殖分化

10、的調(diào)控和軟骨組織工程修復(fù)的研究建立實驗基礎(chǔ)。方法：顯微解剖大鼠長骨骨骺生長板軟骨，酶消化法獲得分散的單細胞懸液。采用percoll不連續(xù)密度梯度離心法分離生長板細胞亞群，分層培養(yǎng)、觀察不同層細胞形態(tài)，并進行細胞生長動力學(xué)分析，電子顯微鏡觀察細胞超微結(jié)構(gòu)，組織化學(xué)和免疫細胞化學(xué)方法檢測不同細胞FGFR-3、X和Ⅱ型膠原的表達。結(jié)果：我們獲得了四層生長板軟骨細胞亞群，細胞活性達到了95％以上；原代培養(yǎng)細胞呈多角形，第8代細胞仍保持多角的形態(tài)

11、；前4代細胞的每日倍增指數(shù)隨著傳代次數(shù)的增加而增加，第8代后顯著降低。依照細胞成熟程度，體積逐漸增大，密度逐層減??；前體細胞表面有FGFR-3的表達，其他層細胞為陰性；隨著細胞的逐漸成熟，Ⅱ型膠原表達逐漸減弱，而X型膠原的表達逐漸增強；隨著傳代次數(shù)增加陽性細胞的比例下降。結(jié)論：骨骺生長板存在四個不同細胞亞群，并能夠通過密度梯度離心法分離，可以獲得高純度、高活性的軟骨細胞亞群。第4代前的細胞表型穩(wěn)定，可以作為研究軟骨增殖分化調(diào)控的細胞平臺

12、。 第二章PTHrp基因的克隆和真核表達載體的構(gòu)建 目的：從大鼠骨骺生長板軟骨細胞增殖區(qū)亞群中克隆PTHrp基因并構(gòu)建其真核表達載體pEGFP-IRES2-PTHrp。方法：Percoll不連續(xù)密度梯度離心法分離大鼠骨骺生長板增殖區(qū)軟骨細胞，提取總RNA，用RT-PCR方法獲得PTHrp基因的全長cDNA，經(jīng)PCR擴增，產(chǎn)物回收純化、雙酶切后連接到真核表達載體pEGFP-IRES2；轉(zhuǎn)化擴增后提取重組質(zhì)粒pEGFP-IR

13、ES2-PTHrp，進行酶切鑒定和序列測定。結(jié)果：總RNA純度、含量均符合要求；PCR產(chǎn)物電泳可在預(yù)期大小處得到清晰條帶，連接轉(zhuǎn)化后獲得2株陽性轉(zhuǎn)化大腸桿菌，大提產(chǎn)物經(jīng)限制性內(nèi)切酶酶切圖譜分析可得到目的基因條帶和載體條帶，DNA序列測定證實目的基因已插入重組質(zhì)粒。結(jié)論：準確從骨骺生長板增殖區(qū)軟骨細胞中克隆了PTHrp基因成功構(gòu)建其真核表達載體pEGFP-IRES2-PTHrp，為進一步揭示PTHrp的生物學(xué)功能及其在在軟骨細胞的分化和骨

14、骼形態(tài)發(fā)生中的作用奠定了良好的基礎(chǔ)。 第三章穩(wěn)定分化軟骨前體細胞株的建立及鑒定 目的：建立穩(wěn)定分化大鼠骨骺軟骨前體細胞株，為細胞移植治療和轉(zhuǎn)基因治療提供穩(wěn)定的細胞來源。方法：利用脂質(zhì)體介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)染技術(shù)將含有甲狀旁腺激素相關(guān)肽(parathroidhormone-relatedpeptide，PTHrp)基因的重組質(zhì)粒pEGFP-IRES2-PTHrp轉(zhuǎn)染至原代培養(yǎng)的新生大鼠軟骨前體細胞，經(jīng)G418篩選，抗性克隆擴大培養(yǎng)

15、傳代。應(yīng)用FGFR-3、Ⅱ型膠原、X型膠原和PTHrp抗體進行免疫細胞化學(xué)鑒定，檢測其表型及分化能力，觀察細胞的形態(tài)及其生長狀況，繪制細胞生長曲線。用RT-PCR、Southernblot和westernblot從不同層次鑒定PTHrp基因在轉(zhuǎn)染細胞中的表達。結(jié)果：轉(zhuǎn)染后獲得1個陽性細胞克隆，免疫細胞化學(xué)證實為具有較強增值能力和多分化潛能的軟骨前體細胞。經(jīng)Southern印跡雜交和Western證實，PTHrp已穩(wěn)定轉(zhuǎn)染入軟骨前體細胞，

16、表達其mRNA及其蛋白。轉(zhuǎn)染細胞經(jīng)擴大培養(yǎng)，命名為穩(wěn)定分化軟骨前體細胞(immortalizedprecartilaginousstemcell，IPSC)。貼壁培養(yǎng)的IPSC，群體倍增時間為23.52h，傳代、凍存和復(fù)蘇對細胞形態(tài)及生長無明顯影響。結(jié)論：PTHrp基因?qū)肟烧T導(dǎo)軟骨前體細胞穩(wěn)定分化，為骨骺軟骨細胞的實驗研究及其介導(dǎo)的細胞移植治療提供了穩(wěn)定的細胞來源。 第四章穩(wěn)定分化軟骨前體細胞株的NMR波譜及其與納米組織工程材

17、料相容性研究 目的：研究穩(wěn)定分化軟骨前體細胞株細胞代謝情況和測定細胞內(nèi)離子濃度；觀察細胞株與的納米組織工程材料相容性，以及材料對細胞增殖、分化的作用的影響。方法：以重水(D2O)緩沖液重懸傳代培養(yǎng)的穩(wěn)定分化軟骨前體細胞，在灌流條件下，利用inova600型液態(tài)核磁共振譜儀測定細胞的31p-NMR波譜，和細胞內(nèi)游離Mg2+濃度，觀察波譜組成及各波峰高度，評價細胞代謝情況。細胞與nanoHA/PDLLA多孔材料復(fù)合培養(yǎng)7天后，進行形

18、態(tài)學(xué)觀察和掃描電鏡觀察及MTT測定，了解細胞增殖及黏附情況。結(jié)果：成功獲得穩(wěn)定分化軟骨前體細胞株31P-NMR波譜，由PCr、ATP、Pi等五個共振峰組成，細胞內(nèi)游離Mg2+濃度為0.326mmol/L，為進一步研究打下基礎(chǔ)。穩(wěn)定分化軟骨前體細胞與nanoHA/PDLLA多孔材料具有良好的相容性，細胞在材料上生長良好，材料對細胞增殖無不良影響。結(jié)論：穩(wěn)定分化軟骨前體細胞的31p-NMR波譜形態(tài)正常，代謝穩(wěn)定；細胞與nanoHA/PDLL