冠心病相關(guān)基因MEF2A的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)及其突變型真核表達載體的構(gòu)建和體外活性研究.pdf

1、背景: 冠狀動脈粥樣硬化性心臟病(冠心病，CAD)是目前我國居民最常見、最重要的引起死亡和致殘的疾病之一。目前隨著分子遺傳學技術(shù)的快速進展，通過連鎖分析和關(guān)聯(lián)研究越來越多與CAD相關(guān)的易感或致病基因被相繼發(fā)現(xiàn)。肌細胞增強因子2A(MEF2A)是目前得到高度重視的冠心病相關(guān)基因，它屬于轉(zhuǎn)錄因子MEF2家族，是與肌細胞發(fā)育、血管發(fā)生密切相關(guān)的重要轉(zhuǎn)錄因子。研究提示MEF2A第11外顯子的相關(guān)突變是第一個以常染色體顯性形式發(fā)揮作用的C

2、AD致病基因，其突變可能導(dǎo)致血管內(nèi)皮和平滑肌等正常組織功能發(fā)生異常而引起CAD的發(fā)生和發(fā)展。之后陸續(xù)進行了對MEF2A第11外顯子的突變情況和CAD間的關(guān)聯(lián)研究，但是由于種族、地區(qū)差異、遺傳異質(zhì)性等原因，關(guān)于MEF2A突變和CAD間聯(lián)系并沒有明確結(jié)論。 目前的研究主要集中在MEF2A基因突變和冠心病的相關(guān)性上，而如果能進一步闡明已知促冠心病發(fā)生的重要危險因素和保護因素對MEF2A轉(zhuǎn)錄活性的影響，以及研究突變型MEF2A蛋白的功能

3、改變，可能更加明確MEF2A的生物學活性及在CAD發(fā)病中的作用，進一步對冠心病的發(fā)病機制有所補充，甚至從根本上對冠心病的病理生理過程提供新的基礎(chǔ)性認識，最終對具有CAD高危遺傳因素個體的早期診斷與篩查有重要的指導(dǎo)意義。 目的: 1、研究體外不同冠心病危險因素和保護因素刺激對人臍靜脈內(nèi)皮細胞(HUVEC)中MEF2A轉(zhuǎn)錄和表達水平的變化，以及可能相關(guān)的信號傳導(dǎo)通路。 2、對冠心病患者MEF2A的第11外顯子進行測序

4、，選擇存在有意義突變的患者的MEF2A基因作為研究的目的基因，構(gòu)建相應(yīng)的突變型MEF2A真核表達重組質(zhì)粒。 3、對突變型MEF2A蛋白在真核細胞的核定位情況進行研究。 4、觀察pEGFP—N1/MEF2A真核表達重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染效率和毒性，評價該方法建立瞬時轉(zhuǎn)染和穩(wěn)定表達細胞系的可行性。 方法: 1、采用體外分離培養(yǎng)HUVEC的方法，以HDL、LDL、oxLDL、Angll和MAPK信號通路阻斷劑SP600

5、125、U0126、SB203580，以及葡萄糖、胰島素單獨或聯(lián)合刺激，設(shè)計不同的刺激濃度梯度和刺激時間，通過Real-TimePCR和WesternBlot分析MEF2A轉(zhuǎn)錄水平和蛋白表達水平的變化。 2、應(yīng)用RT—Nested-PCR的方法，從攜有突變型MEF2A的個體外周血有核細胞得到目的片段，先后與pEASY-T3質(zhì)粒和pEGFP—N1真核表達質(zhì)粒相連接，構(gòu)建pEGFP—N1/MEF2A真核表達重組質(zhì)粒并通過PCR和限制

6、性內(nèi)切酶驗證。 3、通過倒置熒光顯微鏡觀察構(gòu)建成功的突變型和野生型pEGFP—N1/MEF2A真核表達重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293T細胞后EGFP的表達情況，再結(jié)合細胞免疫化學染色觀察所表達MEF2A蛋白的分布和核定位。 4、體外培養(yǎng)HUVEC及EA．hy926細胞，應(yīng)用脂質(zhì)體法探索使pEGFP—N1/MEF2A真核表達重組質(zhì)粒成功表達的最佳轉(zhuǎn)染條件，應(yīng)用倒置熒光顯微鏡在轉(zhuǎn)染2、6、24、48小時等不同時間點觀察轉(zhuǎn)染效率和毒性。

7、 結(jié)果: 1、不同濃度LDL、HDL和oxLDL刺激24小時后會下調(diào)HUVEC中MEF2A的表達，oxLDL刺激24小時后MEF2A的轉(zhuǎn)錄幾乎被完全抑制。 2、高糖、胰島素以及兩者聯(lián)合作用24小時均可下調(diào)HUVEC中MEF2A的表達。 3、不同濃度Angll刺激6小時、12小時、24小時后均上調(diào)HUVEC中MEF2A的表達，呈現(xiàn)明顯的濃度依賴性。加入SB203580后6小時和12小時MEF2A表達顯著降低。

8、加入SP600125以及U0126后24小時MEF2A表達顯著降低。 4、過RT—Nested-PCR的方法成功從冠心病患者外周血得到突變型MEF2A目的基因編碼區(qū)全長序列。 5、成功構(gòu)建正常和突變型pEASY-T3/MEF2A和pEGFP—N1/MEF2A重組質(zhì)粒。 6、△Q424—430、△Q430、△Q429△Q430△431三種突變型及野生型MEF2A蛋白在293T細胞被成功表達。 7、△Q424

9、—430、△Q430、△Q429△Q430△431三種突變與MEF2A蛋白的核定位無關(guān)。 8、MEF2A在體外培養(yǎng)的HUVEC和EA．hy926細胞廣泛表達并主要存在于細胞核。 9、脂質(zhì)體法可以用于體外培養(yǎng)的HUVEC和EA．hy926細胞的轉(zhuǎn)染試驗，轉(zhuǎn)染效率較高、細胞毒性小。但pEGFP—N1/MEF2A真核表達重組質(zhì)粒不能在HUVEC和EA．hy926細胞高效表達。 結(jié)論: 1、本研究通過體外細胞學試

10、驗，證實了HUVEC中MEF2A的轉(zhuǎn)錄和表達水平的調(diào)節(jié)與包括LDL、oxLDL、HDL、葡萄糖、胰島素、Angll在內(nèi)的冠心病相關(guān)的危險和保護因素有關(guān)。Angll對MEF2A轉(zhuǎn)錄水平的影響與Erk1/2、JNK、P38三條信號傳導(dǎo)通路均有關(guān)。 2、本研究通過Nested-PCR技術(shù)解決了MEF2A在外周血有核細胞表達水平低的困難，從突變患者的外周血細胞中成功得到了MEF2A的CDS序列并構(gòu)建了相關(guān)真核表達重組質(zhì)粒。 3、