野生型和P370L突變型Myocilin原核表達載體的構建及蛋白表達的初步研究.pdf

1、青光眼已成為世界第二位的致盲眼病。1997年Stone等在《Science》上首先發(fā)表文章，報道Myocilin基因為家族性開角型青光眼的致病基因。從此，關于Myocilin基因及蛋白的結(jié)構、功能及青光眼的致病作用的研究成為熱點。然而，時至今日，突變型．Myocilin基因及蛋白在家族性開角型青光眼發(fā)病中的致病作用仍存有爭論。 本課題組在國內(nèi)率先對一個家族性開角型青光眼的家系進行了長達20年的追蹤調(diào)查，經(jīng)過系列全面、系統(tǒng)的臨床及

2、實驗室研究，確定Myocilin基因P370L突變是該家系家族性開角型青光眼的致病基因，并將其命名為廣州1號(GZ.1)；最近課題組又在廣東普寧發(fā)現(xiàn)了一個新的家族性開角型青光眼家系，命名為普寧1號(PN．1)，最終測序結(jié)果再次將致病基因鎖定在了MYOC基因Pro370Leu突變，于GZ.1號致病基因的定位完全相同，再次證明了該突變在中國南方家族性開角型青光眼的研究中的普遍性和重要性；課題組后續(xù)的實驗室研究顯示，通過將P370L突變型My

3、ocilin基因真核表達載體瞬時轉(zhuǎn)染人小梁細胞，發(fā)現(xiàn)P370L突變型Myocilin蛋白細胞外分泌障礙，在胞漿內(nèi)形成積聚體，推測其致病機理為P370L突變型Myocilin蛋白錯誤折疊、空間構象發(fā)生改變，進而獲得病理性功能影響小梁細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激反應以及線粒體的功能，引發(fā)小梁細胞級聯(lián)病理反應，影響房水的外流，從而導致青光眼的發(fā)生。本研究為了進一步研究野生型和P370L突變型Myocilin蛋白的功能及結(jié)構特性，通過構建野生型和P370L突

4、變Myocilin基因原核表達載體，并進行了蛋白表達的初步研究，旨在利用原核表達系統(tǒng)，獲得高純度的野生型和P370L突變型Myocilin蛋白，為后續(xù)的工作奠定基礎。 目的 運用分子克隆技術，構建野生型和P370L突變型Myocilin原核表達載體，進行野生型和P370L突變型Myocilin蛋白的體外表達，利用親和層析技術進行蛋白純化，得到野生型和P370L突變型Myocilin蛋白，為下一步的工作奠定基礎。

5、方法 1.應用PCR的方法，以課題組已經(jīng)成功構建的另一真核載體為模板，擴增野生型和P370L突變型Myocilin cDNA； 2.應用T4DNA連接酶連接雙酶切后的目的基因和載體。 3.應用酶切、PCR、測序的方法鑒定重組質(zhì)粒。 4.應用原核表達的方法在大腸桿菌中表達野生型和P370L突變型Myocilin蛋白。 5.應用親和層析的方法進行野生型和P370L突變型Myocilin-GST融合蛋白

6、的純化。 6.應用SDS-PAGE的方法檢測蛋白的表達。 結(jié)果 1.目標基因可高效擴增，所構建載體pGEX-4t-1/E-w和pGEX-4t-1/E-370經(jīng)酶切、PCR、測序鑒定，開放閱讀框無移碼突變，野生型Myocilin目的基因序列無任何突變；P370L突變型Myoeilin序列除370突變外，無任何突變。 2.野生型和P370L突變型Myocilin在原核系統(tǒng)中表達后與陰性對照相比，可出現(xiàn)明顯的蛋白條帶，

7、但是表達量較少；通過親和層析的方法初步純化野生型和P370L突變型Myocilin-GST融合蛋白后，可在目標分子量處看到目標條帶，但條帶較弱，并伴有GST蛋白。 結(jié)論 1.野生型和P370L突變型Myocilin原核表達載體構建成功，分別命名為pGEX-4t-1/E-W和pGEX-4t-1/E-370。 2.野生型和P370L突變型Myocilin在原核系統(tǒng)中可被誘導表達，并且通過親和層析的方法初步純化了野生型