人低氧誘導(dǎo)因子1α-Ala564-Ala803重組腺病毒載體的構(gòu)建、鑒定及表達.pdf

1、背景 冠心病是威脅人類健康的重大疾病之一。其治療措施目前主要有常規(guī)的藥物治療、冠脈介入(percutaneous coronary interyention，PCI)及冠脈旁路移植術(shù)(coronary artery bypass grafting，CABG)，然而相當一部分患者藥物治療難以見效，也不適于常規(guī)血運再通術(shù)處理，因此必須尋求其它方法。近年來，隨著分子生物學(xué)技術(shù)的進步，基因治療促缺血心肌血管新生已成為冠脈血運重建術(shù)中具有

2、發(fā)展前景的新方向。 促血管生長因子研究較多的有血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelialgrowth factor，VEGF)、成纖維細胞生長因子(fibroblast growth factor，F(xiàn)GF)等，然而資料顯示VEGF可導(dǎo)致血管滲漏、組織水腫等，F(xiàn)GF治療則與蛋白尿有關(guān)。目前關(guān)于VEGF、FGF促血管新生的臨床實驗已基本停止。人們正在尋找一些新的基因，以期能誘導(dǎo)成熟的血管新生，而又對人體無其他副作用。

3、低氧誘導(dǎo)因子-1(hypoxia inducible factor 1，HIF-1)是一種能與DNA結(jié)合的蛋白，對多種低氧反應(yīng)性基因(Hypoxia responsive gerles，HRG)的轉(zhuǎn)錄都有調(diào)控作用，并且對血管新生基因有很強的調(diào)控作用。它是由α亞單位和β亞單位組成，其中HIF-1 α是專一受O<,2>調(diào)節(jié)的亞單位，決定了HIF-1的活性。前期研究表明，應(yīng)用具有組成型表達活性的HIF-1α基因治療可誘導(dǎo)生理功能完整的血管新生

4、。在常氧條件下，HIF-1 α ODD區(qū)402、564位的脯氨酸殘基羥基化通過泛素酶系統(tǒng)和蛋白水解將HIF-1 α降解，半衰期不超過5min。低氧條件下，HIF-1α的泛素化和降解過程受抑制，形成有活性的HIF-1蛋白，以發(fā)揮其促血管新生等生物學(xué)功能。而決定HIF-1 α的轉(zhuǎn)錄活性區(qū)位于其羧基端(COOH-terminaltransactivation domain，CAD)的第803位天門冬氨酸，其羥化受阻可導(dǎo)致HIF-1 α的強烈轉(zhuǎn)

5、錄活性。目前應(yīng)用HIF-1 α研究促血管新生均集中在將其原始基因轉(zhuǎn)染到在體動物，通過缺氧模型來研究，而對應(yīng)用定點誘變的HIF-1α進行生物學(xué)功能研究尚報道不多。因此，我們在業(yè)已完成對HIF-1 α Pr0564、Pr0564/Asn803定點突變分析及重組腺病毒載體Adeno-HIF-1α及Adeno-HIF-1α Ala564載體的構(gòu)建基礎(chǔ)上，擬構(gòu)建能在哺乳動物細胞中高表達的攜帶HIF-1α-Ala564-Ala803腺病毒載體。

6、 目的： 構(gòu)建能在哺乳動物細胞中高表達的攜帶HIF-1α-Ala564-Ala 803基因的重組腺病毒載體Adeno-HIF-1α，為進一步研究HIF-1α基因及其突變體對缺血性心臟病的血管新生作用及以后的臨床應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。 方法： 采用分子克隆技術(shù)，以PI-Sce I、I-Ceu I雙酶切重組穿梭質(zhì)粒pShuttle2-HIF-1α-Ala564-Ala803，然后切下含有HIF-1α cDNA的表達盒片段

7、通過體外連接法與線性化的腺病毒骨架質(zhì)粒Adeno-X Viral DNA連接，重組成pAdeno-HIF-1α腺病毒質(zhì)粒，經(jīng)酶切及測序鑒定正確后，在HEK293A細胞中包裝成為重組腺病毒Adeno-HIF-1α-Ala564-Ala803，然后進行PCR鑒定及滴度測定。用重組腺病毒轉(zhuǎn)染293A，Western blot鑒定HIF-1α蛋白表達。 結(jié)果： 經(jīng)酶切鑒定及基因測序證實重組腺病毒質(zhì)粒構(gòu)建成功；包裝后凍融細胞的上清