HIF-1α-Ala564-Ala803增強(qiáng)MSCs對(duì)CoCl-,2-化學(xué)損害心肌細(xì)胞的保護(hù)作用.pdf

1、目的：比較突變型HIF-1α—Ala564-Ala803對(duì)下游VEGF、FGF2和TGF—β1等因子調(diào)節(jié)的生物學(xué)優(yōu)勢(shì)。研究MSCs及HIF-1α—Ala564-Ala803干預(yù)后的MSCs對(duì)CoCl2化學(xué)損害心肌細(xì)胞凋亡的影響，并探討TGF—β1、VEGF、IGF及HSP70在此過(guò)程中的作用機(jī)理。 方法：將各組腺病毒介導(dǎo)的HIF-1α加入MSCs(MOI均為200)，24小時(shí)后以RT—PCR、免疫熒光染色和Western blo

2、t法分別對(duì)感染細(xì)胞進(jìn)行HIF-1α、TGF—β1、VEGF和FGF—2表達(dá)分析。CoCl2設(shè)25、50、100、150、200、300 umol/16個(gè)濃度組，2、4、6、12、24、48小時(shí)6個(gè)時(shí)間組，通過(guò)MTT方法建立體外CoCl2誘導(dǎo)CMCs缺氧模型。實(shí)驗(yàn)共分5組：對(duì)照組、CoCl2誘導(dǎo)缺氧的心肌細(xì)胞組、CoCl2誘導(dǎo)缺氧的心肌細(xì)胞+MSC組、CoCl2誘導(dǎo)缺氧的心肌細(xì)胞+LacZ干預(yù)24h MSC組、CoCl2誘導(dǎo)缺氧的心肌細(xì)胞

3、+HIF-1α—Ala564-Ala803干預(yù)24h MSC組。TUNEL檢測(cè)心肌細(xì)胞凋亡數(shù)目；乳酸脫氫酶(LDH)測(cè)試盒檢測(cè)心肌細(xì)胞損傷標(biāo)志物L(fēng)DH；RT—PCR檢測(cè)TGF—β1、VEGF、HSP70和IGF-1的mRNA水平；Western—blot檢測(cè)caspase—3、Bc1-2、VEGF和TGF—β1的蛋白水平。采用SPSS11.1統(tǒng)計(jì)分析軟件，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次計(jì)量資料以x±s表示，多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析，兩組間比較采用

4、LSD—t檢驗(yàn)。 結(jié)果：常氧下，雙突變型HIF-1α—Ala564-Ala803蛋白不易被泛素蛋白酶降解，至少可持續(xù)24小時(shí)。免疫熒光染色示雙突變型HIF-1α較多集中在核周，部分已經(jīng)入核。對(duì)下游調(diào)節(jié)因子TGF—β1、VEGF和FGF2的轉(zhuǎn)錄激活作用明顯增強(qiáng)(p＜0.05)。CoCl2最佳處理濃度為200umol/1及時(shí)間為6小時(shí)。實(shí)驗(yàn)CMCs共分為5組，同對(duì)照組相比，加入CoCl2各組心肌細(xì)胞均停止節(jié)律性搏動(dòng)，細(xì)胞皺縮體積變小

5、，但細(xì)胞輪廓仍清晰可見(jiàn)多數(shù)呈長(zhǎng)梭型及不規(guī)則型。5組中每100個(gè)心肌細(xì)胞中TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)分別是0.4±0.02、31±5、19±4、18±4.5、3.5±0.5，方差分析差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.05)。除對(duì)照組外，其中CoCl2+HIF-1α+ MSC組的凋亡心肌細(xì)胞最少。將CoCl2+HIF-1α+MSC組同其它CoCl2+MSC組相比較，發(fā)現(xiàn)LDH OD值及caspase—3蛋白表達(dá)降低更明顯，BCL—2蛋白水平、TGF—β1

6、的mRNA及蛋白水平升高增加明顯，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.05)。 結(jié)論：雙突變型HIF-1α—Ala564-Ala803具有完整的生物學(xué)功能，可以代替未突變型HIF-1α成為心血管領(lǐng)域研究和治療的新手段。MSCs能保護(hù)CMCs抗凋亡；HIF-1α—Ala564-Ala803能增強(qiáng)MSCs保護(hù)CMCs的能力。HIF-1α—Ala564-Ala803發(fā)揮增強(qiáng)MSCs保護(hù)心肌細(xì)胞的能力，可能與TGF—β1、BCL—2信號(hào)通路有關(guān)。