脈沖電流刺激對(duì)MSCs與心肌細(xì)胞共培養(yǎng)層分化狀態(tài)的作用研究.pdf

1、一、背景與目的：
　　 冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病(簡(jiǎn)稱冠心病)是臨床常見病、多發(fā)病，嚴(yán)重的危害人類健康。冠心病的最嚴(yán)重類型-急性心肌梗死(AMI)，因冠狀動(dòng)脈急性閉塞和心肌組織急性缺血，可在15～20分鐘內(nèi)導(dǎo)致心肌細(xì)胞不可逆性損傷。心肌梗死后心室發(fā)生重構(gòu)，隨之而來(lái)的是心肌細(xì)胞被替換為纖維組織，導(dǎo)致心肌細(xì)胞收縮功能減退或消失，繼之出現(xiàn)左心室擴(kuò)張等病理改變。
　　 間充質(zhì)干細(xì)胞是已經(jīng)是比較獲得認(rèn)可的可用于心臟移植的細(xì)胞類型，

2、在心肌梗死后，間充質(zhì)干細(xì)胞移植可以減少壞死，分泌許多促進(jìn)血管生成的細(xì)胞因子和改善心臟功能，還有研究認(rèn)為間充質(zhì)干細(xì)胞可作為支持心肌干細(xì)胞生長(zhǎng)重要的支持細(xì)胞。如間充質(zhì)干細(xì)胞可以招募許多的內(nèi)源性干細(xì)胞，這些干細(xì)胞為損傷部位帶了了修復(fù)，而非僅僅間充質(zhì)干細(xì)胞，這其中就包括了非常有潛力的心肌干細(xì)胞。在對(duì)病竇綜合征的研究中，HCN基因家族修飾的間充質(zhì)干細(xì)胞用于重建起搏點(diǎn)。如何更好的促進(jìn)間充質(zhì)干細(xì)胞移植后的分化和移植后的效果也是研究人員不斷探索的方向，

3、其中分子手段是比較有效的方式，但由于慢病毒等手段的臨床應(yīng)用受到限制，而在心血管內(nèi)科治療中各種物理手段在臨床應(yīng)用較多，那么可否使用物理手段干預(yù)間充質(zhì)干細(xì)胞分化過(guò)程?或者改變間充質(zhì)與心肌共培養(yǎng)層分化狀態(tài)?在正常生理狀態(tài)過(guò)程中，內(nèi)源性的電流、電場(chǎng)扮演了影響分化的重要角色，內(nèi)源性的電場(chǎng)對(duì)于胚胎的分化作用十分重要。本課題的目的是探求外源性電干預(yù)可否作為促進(jìn)間充質(zhì)向心肌分化或者改變間充質(zhì)與心肌共培養(yǎng)層分化狀態(tài)的一種手段的可能性與可行性，尋找合適的電

4、干預(yù)參數(shù)，設(shè)計(jì)制作方便實(shí)用的電干預(yù)系統(tǒng)，了解間充質(zhì)干細(xì)胞向心臟分化潛能，尋找其作用的靶點(diǎn)和初步確定了解合適的干預(yù)時(shí)間。
　　 二、研究方法：
　　 1.反復(fù)結(jié)合EPCS使用效果反饋制作了EPCS培養(yǎng)裝置。
　　 2.膜片鉗檢測(cè)電流干預(yù)對(duì)共培養(yǎng)條件下間充質(zhì)干細(xì)胞膜電位的影響，
　　 3.將間充質(zhì)干細(xì)胞分為普通培養(yǎng)組和EPCS處理組，檢測(cè)EPCS對(duì)其增殖(cck-8 andPCNA)，表面標(biāo)記物，形成縫隙連接

5、潛力影響。檢測(cè)EPCS對(duì)其搏動(dòng)維持，搏動(dòng)頻率，及肌鈣蛋白，肌球蛋白表達(dá)在轉(zhuǎn)錄水平的影響。
　　 4.將5-aZa處理后的3w后的小鼠間充質(zhì)干細(xì)胞分為普通培養(yǎng)組和EPCS組，檢測(cè)EPCS對(duì)其誘導(dǎo)效果影響。
　　 5.間充質(zhì)干細(xì)胞分化情況檢測(cè)：間充質(zhì)干細(xì)胞與心肌共培養(yǎng)4-5天后分別檢測(cè)CX43，Nav1.5，CaMKⅡ表達(dá)情況；將間充質(zhì)干細(xì)胞和心肌細(xì)胞按4:1比例種植于培養(yǎng)皿中，取48h，72h和96h進(jìn)行western-b

6、lotting實(shí)驗(yàn)，檢測(cè)CaMKⅡ含量的動(dòng)態(tài)變化。
　　 6.共培養(yǎng)5天后，檢測(cè)共培養(yǎng)層GATA4，MEF2c，TBX5相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)的情況；檢測(cè)蛋白質(zhì)核轉(zhuǎn)運(yùn)受體在共培養(yǎng)層表達(dá)。
　　 7.將細(xì)胞分為兩組，普通共培養(yǎng)培養(yǎng)組和鈣離子通道阻滯共培養(yǎng)組。共培養(yǎng)5天后，檢測(cè)細(xì)胞上VSCC(電壓敏感鈣通道)的表達(dá)和鈣瞬變情況。檢測(cè)MEF2C，GATA4和TBX5表達(dá)情況。檢測(cè)細(xì)胞鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶活力；western-blottin

7、g檢測(cè)細(xì)胞TroponinT，NAV1.5，CACNA1G/H和CX43蛋白含量變化。
　　 8.間充質(zhì)和心肌細(xì)胞在初期接種時(shí)的比例為3:1。每組給予1h/d，3h/d和6h/d的EPCS干預(yù)，EPCS從接種后24h開始，持續(xù)4天，同期接種的未進(jìn)行EPCS干預(yù)的共培養(yǎng)細(xì)胞作為對(duì)照組。用蛋白印跡法檢測(cè)troponinT和CX43在每個(gè)不同時(shí)間處理組表達(dá)含量。
　　 9.用免疫熒光檢測(cè)EPCS連續(xù)處理5d組，及對(duì)照組在S10

8、0A4，MEF2C，troponinT，CX43和GATA4表達(dá)情況。
　　 三、研究結(jié)果：
　　 1.結(jié)合試驗(yàn)反饋反復(fù)摸索分析中制備了一套穩(wěn)定可靠的電刺激給予和接受裝置(EPCS培養(yǎng)系統(tǒng))，我們可實(shí)時(shí)對(duì)其干預(yù)信號(hào)監(jiān)測(cè)，這套系統(tǒng)便于使用和準(zhǔn)確給予EPCS刺激。
　　 2.膜片鉗檢測(cè)顯示在共培養(yǎng)條件下的間充質(zhì)干細(xì)胞在接受到膜片鉗儀器提供直流電流刺激后產(chǎn)生膜電位微小改變。
　　 3.在心肌細(xì)胞長(zhǎng)期體外培養(yǎng)中E

9、PCS可以維持少數(shù)區(qū)域較良好的搏動(dòng)狀態(tài)和形態(tài)。
　　 4.安全性檢測(cè)方面：EPCS對(duì)心肌細(xì)胞搏動(dòng)頻率未見明顯影響；EPCS不影響間充質(zhì)干細(xì)胞增殖(cck-8實(shí)驗(yàn)，PCNA蛋白含量檢測(cè))，形成縫隙連接的潛能；EPCS對(duì)間充質(zhì)干細(xì)胞表面標(biāo)記物中的CD44分子具有輕度下調(diào)作用，不隨每日干預(yù)時(shí)間延長(zhǎng)增加下調(diào)幅度；EPCS處理9天，在體外培養(yǎng)共計(jì)12天的心肌細(xì)胞其肌鈣蛋白，肌球蛋白基因轉(zhuǎn)錄水平未見影響。EPCS對(duì)5-aza誘導(dǎo)的間充質(zhì)干細(xì)

10、胞過(guò)程未見影響。
　　 5.狗間充質(zhì)干細(xì)胞心肌分化潛能鑒定：在于心肌細(xì)胞共培養(yǎng)后，間充質(zhì)干細(xì)胞可以出現(xiàn)縫隙連接蛋白，鈉離子通道Nav1.5，CaMKⅡ，和轉(zhuǎn)錄因子GATA4，MEF2C和TBX5表達(dá)。GATA4在心肌細(xì)胞核的濃度遠(yuǎn)高于間充質(zhì)干細(xì)胞，是其在間充質(zhì)細(xì)胞核的4.49倍，P<0.01。間充質(zhì)與心肌細(xì)胞培養(yǎng)層(4:1)中CaMKⅡ含量隨共培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)逐漸升高，CaMKⅡ表現(xiàn)出強(qiáng)上升趨勢(shì)，尤其是共培養(yǎng)后72-96小時(shí)。在核轉(zhuǎn)

11、運(yùn)受體中，Karyopherinα3的分布間充質(zhì)干細(xì)胞和心肌細(xì)胞的分布有比較明顯的差異，Karyopherinα4和Karyopherinα5在間充質(zhì)干細(xì)胞和部分心肌細(xì)胞上存在差異，Karyopherinβ1，Karyopherinα1/6，和Karyopherinα2在間充質(zhì)干細(xì)胞和心肌細(xì)胞的分布無(wú)明顯差異，其中Karyopherinα3表達(dá)更強(qiáng)的心肌細(xì)胞的陽(yáng)性比例與核富集GATA4心肌細(xì)胞的比例相似(90％)。鈣通道阻滯誘發(fā)原代培養(yǎng)

12、心肌細(xì)胞內(nèi)成纖維細(xì)胞強(qiáng)烈增生和S100A4表達(dá)升高。間充質(zhì)干細(xì)胞表面鈣離子離子通道的形成較強(qiáng)依賴于正常鈣電流活動(dòng)。阻斷鈣離子流培養(yǎng)對(duì)間充質(zhì)干細(xì)胞鈣瞬變產(chǎn)生幅度減小和時(shí)間縮短影響。鈣離子通道阻滯導(dǎo)致間充質(zhì)心肌細(xì)胞共培養(yǎng)層部分心肌轉(zhuǎn)錄因子升高，但未見引發(fā)下游結(jié)構(gòu)蛋白含量增高。
　　 6.CX43和TroponinT隨每天EPCS干預(yù)時(shí)間的延長(zhǎng)顯示出逐漸上升趨勢(shì)。CX43在3h/d組和6h/d組表現(xiàn)出1.5倍和1.7倍的升高(與對(duì)照組

13、比較，p<0.01)；肌鈣蛋白T在3h/d和6h/d組表現(xiàn)出3.6倍(P<0.01)和4.4倍(P<0.05)的升高。
　　 7.在5天連續(xù)的EPCS處理后，發(fā)現(xiàn)S100A4升高顯著，其在心肌細(xì)胞是對(duì)照組的2.33倍(P<0.01)在間充質(zhì)干細(xì)胞是對(duì)照組的1.99倍(P<0.01)。在心肌細(xì)胞MEF2C和GATA4的表達(dá)量升高了1.63倍(P<0.01)和1.57倍(P<0.01)，在心肌細(xì)胞EPCS可促進(jìn)MEF2C在細(xì)胞核集中

14、表達(dá)，同時(shí)我們也發(fā)現(xiàn)了更多數(shù)量的雙核心肌細(xì)胞，MSC則對(duì)于EPCS觸發(fā)出現(xiàn)的MEF2C升高沒有反應(yīng)，MEF2C在心肌細(xì)胞胞漿和細(xì)胞核的升高可以將共培養(yǎng)體系中的心肌細(xì)胞和間充質(zhì)干細(xì)胞較清晰區(qū)分開來(lái)。也有一些指標(biāo)在EPCS處理后在心肌細(xì)胞和間充質(zhì)干細(xì)胞均出現(xiàn)升高，這包括強(qiáng)烈升高的troponin T和升高幅度相對(duì)弱些的CX43，其中肌鈣蛋白T在心肌細(xì)胞為對(duì)照組的2倍(P<0.01)，CX43的表達(dá)在心肌細(xì)胞為對(duì)照組的1.4倍(P<0.05)

15、；在間充質(zhì)干細(xì)胞肌鈣蛋白T為對(duì)照組1.88倍(P<0.01)，CX43為對(duì)照組的1.94倍(P<0.01)，在共培養(yǎng)層中，EPCS組心肌細(xì)胞S100A4和troponin t出現(xiàn)了明顯的核聚集現(xiàn)象，極少M(fèi)SC上有此現(xiàn)象。
　　 四、結(jié)論：
　　 1.合適的EPCS干預(yù)是一種非常有效地多靶位干預(yù)間充質(zhì)干細(xì)胞和心肌細(xì)胞共培養(yǎng)層分化程度的物理方式。
　　 2.間充質(zhì)干細(xì)胞細(xì)胞核中GATA4得含量遠(yuǎn)低于其在心肌細(xì)胞核含量

16、。在蛋白核轉(zhuǎn)運(yùn)受體中，Karyopherin3的分布間充質(zhì)干細(xì)胞和心肌細(xì)胞的分布有比較明顯的差異，Karyopherin4和Karyopherin5在間充質(zhì)干細(xì)胞和部分心肌細(xì)胞上存在差異。
　　 3.間充質(zhì)干細(xì)胞鈣離子通道的形成依賴于共培養(yǎng)后共培養(yǎng)層正常鈣電流活動(dòng)。
　　 4.間充質(zhì)干細(xì)胞在接受EPCS方面的敏感性和廣泛性上不及心肌細(xì)胞。EPCS處理后，S100A4，TroponinT雖然有整體水平升高，但心肌出現(xiàn)的出現(xiàn)

17、的核內(nèi)較胞質(zhì)更加富集現(xiàn)象在間充質(zhì)干細(xì)胞鮮見，提示間充質(zhì)干細(xì)胞部分分化障礙可能和重要分化相關(guān)蛋白質(zhì)主動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)入核相關(guān)。在心肌細(xì)胞和間充質(zhì)培養(yǎng)層中，心肌分化重要轉(zhuǎn)錄因子MEF2C在間充質(zhì)干細(xì)胞的表達(dá)不受EPCS干預(yù)升高，而在心肌細(xì)胞升高，提示間充質(zhì)干細(xì)胞本身對(duì)EPCS感受性有限。
　　 5.EPCS引起間充質(zhì)干細(xì)胞S100A4升高，而既往文獻(xiàn)認(rèn)為S100A4是頂葉內(nèi)胚層分泌促進(jìn)心肌分化的因子之一，說(shuō)明EPCS可能增強(qiáng)間充質(zhì)干細(xì)胞在間充