內(nèi)鏡超聲探頭引導(dǎo)下乙醇瘤內(nèi)注射治療胰腺癌的實驗研究.pdf

1、胰腺癌是常見的惡性腫瘤之一，惡性程度高，每年導(dǎo)致全球超過250，000人死亡。隨著診療水平的提高和生活方式的改變，我國胰腺癌的發(fā)病率有逐年提高的趨勢，資料顯示，我國胰腺癌的發(fā)病率自20世紀(jì)50年代至90年代增加了近5倍。由于胰腺癌早期缺乏典型臨床表現(xiàn)，待明確診斷時90％患者已出現(xiàn)局部浸潤及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移而無法根治性切除。盡管吉西他濱已成為治療晚期胰腺癌患者的標(biāo)準(zhǔn)化療藥物，一定程度上延長了患者的生存期，但其1年生存率僅為20％左右。
　　

2、 內(nèi)鏡超聲(endoscopic ultrasonography, EUS)應(yīng)用于臨床已有30多年，早期EUS僅作為一種診斷方法應(yīng)用于臨床。近年來，隨著EUS技術(shù)的發(fā)展及線陣超聲掃描探頭的應(yīng)用，使得EUS引導(dǎo)下細(xì)針穿刺活檢(EUS guided fine-needle aspiration，EUS-FNA)在臨床應(yīng)用取得重大進展，在此基礎(chǔ)上經(jīng)EUS引導(dǎo)下胰腺癌的介入治療也進一步發(fā)展起來，出現(xiàn)了EUS引導(dǎo)下細(xì)針注射治療、消融治療、光動力

3、學(xué)治療、基因治療和放射性粒子植入等治療方法。盡管有些技術(shù)處于實驗研究階段，但胰腺病學(xué)界對晚期胰腺癌局部介入治療研究的熱情正持續(xù)高漲。近年來也有EUS引導(dǎo)下給予乙醇注射治療胰腺腫瘤的報道。
　　 超聲引導(dǎo)下無水乙醇注射在腎囊腫、肝囊腫及原發(fā)性肝癌等治療方面已取得較好的療效。近年來，EUS引導(dǎo)下乙醇注射在胰腺腫瘤治療中也取得一定的進展。為了評價乙醇在胰腺腫瘤治療方面的安全性，有研究者在EUS引導(dǎo)下對正常豬胰腺組織進行乙醇注射，結(jié)果發(fā)

4、現(xiàn)接受乙醇注射的實驗動物均無胰腺炎的發(fā)生，并在胰腺注射部位出現(xiàn)炎性、壞死和纖維化，認(rèn)為乙醇應(yīng)用于胰腺腫瘤的治療是安全的。有文獻(xiàn)報道了EUS引導(dǎo)下乙醇灌注及乙醇灌注加紫杉醇治療胰腺囊性腫瘤，取得較好的療效，沒有嚴(yán)重并發(fā)癥的發(fā)生。另外，有一些關(guān)于EUS引導(dǎo)下乙醇注射治療胰腺神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤的報道，因患者拒絕接受手術(shù)治療，在EUS引導(dǎo)下給予乙醇注射治療，治療后均取得較好的療效，沒有嚴(yán)重并發(fā)癥的發(fā)生。
　　 高濃度乙醇消融治療的機制是利用

5、乙醇對腫瘤組織的迅速脫水固定作用，使蛋白質(zhì)發(fā)生變性，腫瘤內(nèi)血管收縮，血管壁變性及內(nèi)皮細(xì)胞破壞，局部血栓形成，導(dǎo)致組織壞死，同時可使腫瘤細(xì)胞破壞，并引起炎性細(xì)胞浸潤和成纖維細(xì)胞增生，進而發(fā)生纖維化，達(dá)到最大程度滅活腫瘤細(xì)胞。高濃度乙醇給于瘤內(nèi)注射后，隨著乙醇向周圍擴散，會形成一個從注射點到周圍腫瘤組織的乙醇濃度梯度，乙醇濃度高的地方，腫瘤細(xì)胞會發(fā)生脫水，變性，導(dǎo)致腫瘤組織壞死，但是周圍濃度低的區(qū)域不足以使腫瘤細(xì)胞發(fā)生壞死，是否有其它的效應(yīng)

6、及機制還不清楚。近年來，國內(nèi)外均有報道低濃度乙醇可以誘導(dǎo)腸上皮細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞、角膜細(xì)胞以及肝癌細(xì)胞等多種細(xì)胞凋亡。乙醇濃度從幾毫摩爾到幾百毫摩爾，也有報道以乙醇在培養(yǎng)基中體積百分比代表其濃度。有研究者用低濃度乙醇體外處理肝癌細(xì)胞，結(jié)果發(fā)現(xiàn)低濃度乙醇可通過死亡受體途徑誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡。
　　 基于以上的研究，我們嘗試進行高濃度乙醇治療胰腺癌的實驗研究，首先通過皮下移植瘤模型篩選治療胰腺癌合適的乙醇濃度，再構(gòu)建裸鼠原位胰腺癌模型，在

7、EUS探頭引導(dǎo)下行乙醇瘤內(nèi)注射治療，評價乙醇治療胰腺癌的安全性及其療效，并進一步探討彌散至腫瘤周圍的低濃度乙醇是否可誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，為乙醇治療胰腺癌提供理論基礎(chǔ)和依據(jù)。實驗主要包括以下三個部分:
　　 一、不同濃度乙醇對裸鼠移植性胰腺癌治療療效觀察的實驗研究
　　 目的評價不同濃度乙醇瘤內(nèi)注射治療裸鼠移植性胰腺癌的療效，為臨床選擇治療療效好且毒副作用少的乙醇濃度來治療胰腺癌提供實驗依據(jù)。
　　 方法構(gòu)建胰腺癌裸

8、鼠皮下移植瘤模型，選腫瘤大小相近的裸鼠48只，將其隨機分為6組，每組8只，A組:0％乙醇組（生理鹽水），B組:20％乙醇組;C組:40％乙醇組;D組:60％乙醇組;E組:80％乙醇組;F組:95％乙醇組。治療前后用游標(biāo)卡尺測量腫瘤最長徑(a)和最短徑(b)，計算腫瘤體積，并計算相對腫瘤體積(RTV)和相對腫瘤體積增殖率(T/C)。治療后第7天處死裸鼠，取腫瘤組織行病理組織學(xué)檢查。
　　 結(jié)果20％乙醇治療組的RTV和T/G與對照

9、組接近(P=0.212);40％、60％、80％和95％治療組的RTV明顯低于對照組(P＜0.01)，其中60％、80％和95％治療組的T/G低于30％;80％和95％治療組的RTV明顯低于60％治療組（P=0.003和P=0.009），而80％和95％治療組的RTV接近(P=0.819)。病理組織學(xué)顯示對照組(0％)未見腫瘤壞死，20％和40％乙醇組腫瘤瘤體內(nèi)可見少量壞死，而60％、80％和95％乙醇組的瘤體內(nèi)出現(xiàn)大面積凝固性壞死。<

10、br>　　 結(jié)論80％乙醇瘤內(nèi)注射治療裸鼠皮下移植性胰腺癌可達(dá)到與95％乙醇治療組相似的療效。
　　 二、內(nèi)鏡超聲探頭引導(dǎo)下乙醇瘤內(nèi)注射治療胰腺癌的實驗研究
　　 目的評價80％乙醇瘤內(nèi)注射治療裸鼠原位胰腺癌的療效及其安全性，以期為晚期胰腺癌微創(chuàng)介入治療提供新的治療方法。
　　 方法構(gòu)建裸小鼠原位胰腺癌模型，選腫瘤大小相近的原位胰腺癌裸鼠20只，隨機分為2組，每組10只:實驗組:80％乙醇;對照組:生理鹽水。在

11、EUS探頭引導(dǎo)下將藥物局部注射至裸小鼠瘤體內(nèi)。治療前及治療后第7天在EUS探頭引導(dǎo)下測量腫瘤大小，計算腫瘤體積、相對腫瘤體積（RTV）和相對腫瘤體積增殖率(T/C)。治療前和治療后24h檢測血清淀粉酶。光學(xué)顯微鏡下觀察治療前后腫瘤組織病理改變。
　　 結(jié)果實驗組相對腫瘤體積（RTV）明顯低于對照組(0.47±0.09 v1.24±0.04，P＜0.01);實驗組T/C％=38％。實驗組治療后24h血清淀粉酶出現(xiàn)輕度增高，但治療前

12、后對血清淀粉酶的影響無統(tǒng)計學(xué)差異(P=0.059)，與對照組相比，實驗組對淀粉酶的影響也無統(tǒng)計學(xué)差異(P=0.13)。病理組織學(xué)檢查顯示實驗組腫瘤壞死變性嚴(yán)重，有大面積凝固性壞死，而對照組僅見少量壞死。
　　 結(jié)論80％乙醇瘤內(nèi)注射可造成腫瘤壞死，在裸鼠原位胰腺癌模型中有一定的治療效果。
　　 三、低濃度乙醇誘導(dǎo)人胰腺癌細(xì)胞凋亡的研究
　　 目的探討低濃度乙醇對胰腺癌細(xì)胞株凋亡的誘導(dǎo)作用。
　　 方法用含

13、不同濃度乙醇（0％、2％、4％和6％）的培養(yǎng)液培養(yǎng)胰腺癌細(xì)胞株SW1990，培養(yǎng)6h后，用CCK8法檢測不同濃度乙醇對胰腺癌細(xì)胞株細(xì)胞增殖的影響，流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞的凋亡。實時熒光定量PCR法檢查凋亡相關(guān)基因caspase8 mRNA、caspase9mRNA的表達(dá)水平變化;westernblot檢測caspase3蛋白表達(dá)水平的變化。結(jié)果低濃度乙醇可抑制SW1990細(xì)胞的增殖，隨著濃度的增加，細(xì)胞存活率明顯下降，與對照組（0％組）相比

14、均有統(tǒng)計學(xué)差異(P＜0.05)。流式細(xì)胞檢測顯示2％、4％和6％乙醇組均可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，與對照組（0％組）相比均有統(tǒng)計學(xué)差異(P＜0.05)。caspase8 mRNA在2％、4％和6％乙醇組的表達(dá)與對照組相比未見明顯增加(P＞0.05);而caspase9 mRNA在2％、4％和6％乙醇組中的表達(dá)均增加，且與對照組相比均有統(tǒng)計學(xué)差異(P＜0.05)?；钚缘腸aspase3蛋白在2％、4％和6％乙醇組中均有表達(dá)，而對照組未見活性的cas