靶向Survivin的RNAi治療垂體腺瘤的研究.pdf

1、RNA干擾技術(shù)是目前新興且日益成熟的的基因沉默技術(shù)，目前被認(rèn)為是基因工程學(xué)領(lǐng)域的非常有效的研究工具。用此技術(shù)可以高效穩(wěn)定特異地阻止目標(biāo)基因的表達(dá)，從而達(dá)到較為理想的沉默效果。目前，dsRNA，特別是siRNA已被廣泛而成功地應(yīng)用于諸如基因功能研究以及疾病病因與治療研究等多個(gè)領(lǐng)域。 Survivin是耶魯大學(xué)Ambrosini等于1997年發(fā)現(xiàn)的，是凋亡抑制蛋白家族新成員，具有分子量小、功能強(qiáng)大等特點(diǎn)。它是迄今發(fā)現(xiàn)的最強(qiáng)的凋亡抑

2、制因子，主要分布于胚胎及分化未成熟的組織。在成人體內(nèi)除胸腺及胎盤中有微量表達(dá)外，所有分化成熟的組織，包括外周血白細(xì)胞、淋巴結(jié)、脾、胰、腎、骨骼肌、心、肝、肺、腦組織中均無表達(dá)，而在人類腫瘤中幾乎都表達(dá)。并且Survivin與腫瘤的侵襲性密切相關(guān)。 本研究方法是：首先，檢測Survivin在垂體腺瘤中的蛋白表達(dá)，探討Survivin與垂體腺瘤侵襲性發(fā)生的相關(guān)性以及它們之間的內(nèi)在聯(lián)系。然后，通過設(shè)計(jì)在垂體瘤細(xì)胞中穩(wěn)定高效表達(dá)的Sur

3、vivin-siRNA質(zhì)粒載體，研究該重組載體對于垂體瘤細(xì)胞中Survivin的干擾效果，并進(jìn)一步明確干擾前后垂體瘤細(xì)胞的增殖及凋亡水平變化，以期探討Survivin是否可成為未來進(jìn)行垂體瘤基因治療研究的有效靶點(diǎn)。 第一部分 Survivin在垂體瘤中的表達(dá)及與生物學(xué)行為關(guān)系 目的: Survivin是凋亡抑制蛋白家族非常獨(dú)特的成員，其基因在腫瘤中的表達(dá)與增加腫瘤的侵襲性和降低患者的生存率關(guān)系密切。本研究目的是

4、檢測Survivin基因在垂體腺瘤中的蛋白表達(dá)，并探討Survivin與垂體腺瘤侵襲性發(fā)生的相關(guān)性以及它們之間的內(nèi)在聯(lián)系。 方法: 1．標(biāo)本 回顧性隨機(jī)收集2006年7月-2008年4月期間山東省立醫(yī)院神經(jīng)外科的垂體腺瘤手術(shù)標(biāo)本66例，其中女性29例（年齡29-77歲，平均年齡65．3±4．3歲），男性37例（年齡34-82歲，平均年齡68．1±2．5歲）。依據(jù)MRI提示腫瘤侵犯海綿竇或有骨質(zhì)破壞，和/或術(shù)中觀察

5、腫瘤對周圍骨質(zhì)、海綿竇有/無侵犯等情況分為侵襲性組（39例）和非侵襲性組（27例）。所有病例診斷均有術(shù)后的免疫組化病理證實(shí)。 2．免疫組化染色方法 采用免疫組化鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化物酶連接（S-P）法，按標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)流程，檢測Survivin基因在侵襲性和非侵襲性垂體瘤中的蛋白表達(dá)。 3．結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn) 根據(jù)半定量免疫組織化學(xué)評價(jià)Survivin反應(yīng)陽性細(xì)胞顯色強(qiáng)度。在高倍視野（×400）下，每張切片隨機(jī)

6、觀察5個(gè)視野的腫瘤細(xì)胞，計(jì)算200個(gè)腫瘤細(xì)胞免疫反應(yīng)陽性的細(xì)胞百分比。每張切片分別有四名實(shí)驗(yàn)者進(jìn)行單獨(dú)評價(jià)，對于有分歧的進(jìn)行重復(fù)評價(jià)，直至達(dá)到一致。 Survivin表達(dá)評估：強(qiáng)陽性（+++）：陽性細(xì)胞大于50％或顯色深；中度陽性（++）：陽性細(xì)胞10％至50％之間或染色略深；弱陽性（+）：陽性細(xì)胞小于10％或顯色淺；陰性（-）：無陽性細(xì)胞染色。 4．統(tǒng)計(jì)分析 用卡方檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。SPSS（版本13．0）統(tǒng)計(jì)

7、學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。設(shè)定p<0．05有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 結(jié)果: Survivin在垂體瘤中以細(xì)胞質(zhì)著色為主，僅有散在的細(xì)胞核著色。Survivin總的陽性率為69．7％（46/66）。在侵襲性垂體瘤中Survivin的陽性率為89．7％（35/39）：而在非侵襲性垂體瘤中Survivin的陽性率僅為40．7％（11/27）?？ǚ綑z驗(yàn)示兩組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（x2=14．309， P=0．0002<0．05）。另外，在免疫組化反應(yīng)為

8、陽性的侵襲性垂體瘤中以強(qiáng)陽性和中度陽性為主（71．4％，25/35），而在非侵襲性垂體瘤中以弱陽性為主（72．7％，8/11）。 結(jié)論: 1．Survivin在垂體瘤中有高表達(dá)。 2．Survivin在侵襲性與非侵襲性垂體腺瘤中的表達(dá)有顯著性差異，因此Survivin與垂體瘤的侵襲性密切相關(guān)。 3．Survivin可以作為判斷垂體腺瘤侵襲性生長的有效指標(biāo)和用做垂體瘤基因治療研究的靶點(diǎn)。 第二部分設(shè)

9、計(jì)并篩選針對Survivin有效的siRNA載體 目的: 設(shè)計(jì)并合成3組針對Survivin基因的siRNA質(zhì)粒載體，并篩選出其中2組有效的載體，為下一步的研究做準(zhǔn)備。 方法: 1．設(shè)計(jì)并合成siRNA載體 本實(shí)驗(yàn)運(yùn)用公眾網(wǎng)站設(shè)計(jì)軟件，針對大鼠的Survivin靶基因序列，設(shè)計(jì)3組siRNA載體，分別標(biāo)記為1＃，2＃，3＃；同時(shí)合成1組為陰性對照載體，標(biāo)記為0＃。然后進(jìn)行測序比對。結(jié)果顯示四組載體

10、被成功構(gòu)建，測序無誤。 2．轉(zhuǎn)染工具細(xì)胞株（膠質(zhì)瘤C6） 培養(yǎng)生長狀態(tài)良好的工具細(xì)胞（膠質(zhì)瘤C6），轉(zhuǎn)染前一天將細(xì)胞分入6-孔培養(yǎng)板培養(yǎng)，轉(zhuǎn)染當(dāng)天按實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的分組情況加入不同質(zhì)粒載體進(jìn)行細(xì)胞的轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)。轉(zhuǎn)染48小時(shí)后熒光顯微鏡下觀察GFP表達(dá)情況，觀測轉(zhuǎn)染效率。 3．檢測干擾效果，篩選有效載體。 選出轉(zhuǎn)染效率為90％左右的組，采用FQ-PCR的方法檢測目的基因的mRNA表達(dá)情況，進(jìn)而判斷不同靶點(diǎn)的干擾效果

11、，篩選出2組有效載體。 結(jié)果: 1．在3組siRNA載體中，1＃、2＃、3＃轉(zhuǎn)染效率分別為87．4±6．2％、92．6±4．5％、75．3±11．0％；陰性對照載體0＃的轉(zhuǎn)染效率為95．0±4．2％。 2．3個(gè)靶點(diǎn)均有敲減效果。與陰性對照載體0＃對比，載體1＃，2＃，3＃敲減效率分別為68．4％、44．4％、22．7％。綜合轉(zhuǎn)染效率及敲減效果，1＃、2＃是最佳的靶點(diǎn)。 結(jié)論: 1．本部分實(shí)驗(yàn)成功構(gòu)

12、建了3組特異性針對大鼠基因Survivin的siRNA載體。 2．通過該部分實(shí)驗(yàn)，我們成功地從3組重組載體中篩選出高效率的靶點(diǎn)，為下一步選用高效率的重組載體對垂體瘤細(xì)胞GH3進(jìn)行轉(zhuǎn)染提供了可靠的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。 第三部分 RNAi沉默Survivin基因?qū)Υ贵w瘤細(xì)胞增殖及凋亡水平的影響 目的: 利用構(gòu)建好的特異性強(qiáng)、轉(zhuǎn)染率高的攜帶針對Survivin的siRNA載體1＃、2＃，研究它們介導(dǎo)RNA干擾對垂體瘤細(xì)胞

13、株GH3增殖和凋亡的影響及其意義。 方法: 1．分別利用siRNA載體1＃、2＃轉(zhuǎn)染垂體瘤細(xì)胞株（GH3細(xì)胞） 培養(yǎng)生長狀態(tài)良好的目的細(xì)胞（即GH3細(xì)胞），轉(zhuǎn)染前一天將目的細(xì)胞分入6-孔培養(yǎng)板培養(yǎng)，轉(zhuǎn)染當(dāng)天按實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的組別分別利用siRNA載體1＃、2＃和對照載體0＃進(jìn)行垂體瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)。 2．用G418篩選出穩(wěn)定的轉(zhuǎn)染細(xì)胞株 將細(xì)胞稀釋到1000個(gè)細(xì)胞/ml，在100μg/ml-1mg/ml

14、的G418濃度范圍內(nèi)進(jìn)行篩選，選擇出在10-14天內(nèi)使細(xì)胞全部死亡的最低G418濃度來進(jìn)行下一步的篩選試驗(yàn)。在轉(zhuǎn)染24小時(shí)之后才開始加G418篩選。隨著細(xì)胞的代謝G418的濃度和活性都會(huì)下降，所以每3-5天都要更換一次含有G418的篩選液。熒光顯微鏡下觀察GFP表達(dá)情況，14天后，即可篩選出穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞株。 3．測定基因沉默效果 分別采用FQ-PCR的方法檢測目的基因的mRNA表達(dá)情況和用Western-blot方法檢

15、測Survivin蛋白表達(dá)，測定基因沉默效果。 4．MTT檢測細(xì)胞增殖水平 培養(yǎng)生長狀態(tài)良好且已穩(wěn)定轉(zhuǎn)染垂體瘤細(xì)胞（GH3細(xì)胞）。按實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的分組（空白對照組，陰性對照組以及陽性組）情況，將細(xì)胞分入96-孔培養(yǎng)板培養(yǎng)。第2天后進(jìn)行MTT分析，檢測對RNAi靶點(diǎn)有效干擾后的垂體瘤細(xì)胞增殖水平變化。 5．PI染色流式細(xì)胞技術(shù)檢測GH3細(xì)胞的細(xì)胞凋亡 培養(yǎng)生長狀態(tài)良好且已穩(wěn)定轉(zhuǎn)染垂體瘤細(xì)胞（GH3細(xì)胞）。按實(shí)驗(yàn)

16、設(shè)計(jì)的分組（空白對照組，陰性對照組以及陽性組）情況，進(jìn)行PI染色流式細(xì)胞儀分析，檢測對RNAi靶點(diǎn)有效干擾后的垂體瘤細(xì)胞周期及凋亡的變化。 結(jié)果: 1．FQ-PCR結(jié)果顯示，siRNA載體1＃、2＃對GH3細(xì)胞中Survivin基因的表達(dá)有顯著敲減作用。它們的敲減效率分別為54．4％和54．0％。Western-blot結(jié)果顯示了類似的結(jié)果。 2．MTT檢測細(xì)胞增殖水平實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，實(shí)驗(yàn)組1＃，2＃的增殖抑制率（

17、IR）分別為42．5％和38．7％，與陰性對照組和空白對照組相比差異有顯著性（P<0．05），這一結(jié)果提示在Survivin被沉默后，垂體瘤細(xì)胞的增殖能力明顯減弱，腫瘤細(xì)胞的生長能力明顯被抑制。 3．通過PI染色流式細(xì)胞方法檢測細(xì)胞群體中各時(shí)期細(xì)胞的比例，我們發(fā)現(xiàn)，兩個(gè)siRNA載體組與對照組比較，在Survivin被沉默以后，垂體瘤細(xì)胞群體中，凋亡細(xì)胞增加（P<0．05）。 結(jié)論: 1．Survivin基因?qū)τ?/p>