人IFN-γ在表達HBsAg肝細胞中的特異性表達及其體外抑制乙肝病毒的作用.pdf

1、干擾素γ(interferon gamma, IFNγ)在宿主抵抗肝炎病毒的過程中發(fā)揮著重要的作用。IFNγ能通過非細胞溶解方式抑制乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)感染肝細胞中HBV的復(fù)制中間體并降解HBV在復(fù)制過程中產(chǎn)生的前基因組RNA，從而顯著降低了細胞中的病毒水平。IFNγ的這些作用已經(jīng)在細胞水平和HBV轉(zhuǎn)基因或HBV感染的動物模型中得到證實。然而在臨床上如果給HBV患者全身應(yīng)用重組人IFNγ，為了保證I

2、FNγ在肝細胞中達到有效治療濃度，就需要較大劑量的應(yīng)用IFNγ以獲得相應(yīng)的血藥濃度，這樣就會導(dǎo)致因IFNγ帶來的嚴(yán)重全身不良反應(yīng)而停止治療的后果。因此，建立一種肝細胞特異性的、可調(diào)控的IFNγ表達的基因治療方法成為最佳解決方案。
　　我國是乙型肝炎的高發(fā)區(qū)，我國一般人群的HBV表面抗原(hepatitis B virussurface antigen，HBsAg)攜帶率高達10％，約占全世界HBsAg攜帶者人數(shù)的1/3以上，其中7

3、5-90％的原發(fā)性肝癌與此有關(guān)。由于整合在人體基因組的HBV基因片段中，以S基因、X基因和增強子Ⅰ最多，其中S基因啟動子具有很強的啟動轉(zhuǎn)錄功能，HBsAg過表達是肝細胞變性壞死的原因之一。根據(jù)這一特性，我們構(gòu)建了具有內(nèi)源性生理調(diào)控功能的人IFNγ表達載體，能夠介導(dǎo)目的基因在表達HBsAg肝細胞中的特異性表達。通過以HBV持續(xù)轉(zhuǎn)錄的S基因為靶基因，利用生理調(diào)控性的基因治療載體，攜帶效應(yīng)基因IFNγ，能很好的提高局部感染肝細胞周圍的IFNγ

4、濃度，細胞特異性地非細胞溶解性清除HBV。由于載體的細胞特異性調(diào)控作用，未感染病毒的肝細胞周圍的IFNγ濃度不會增高，并且IFNγ的表達也不會處于無調(diào)控的持續(xù)表達狀態(tài)，因此不會高水平激活體內(nèi)免疫系統(tǒng)，誘發(fā)肝細胞大量壞死，造成暴發(fā)性肝炎的發(fā)生。
　　第一部分在表達HBsAg肝細胞中特異性表達的人IFNγ真核表達載體（pcDNA3.1-SCⅡ）的構(gòu)建
　　目的:
　　課題組成員在既往工作中成功構(gòu)建了含有效生物學(xué)功能的丙型肝

5、炎病毒(hepatitis Cvirus，HCV)核糖體插入位點（internal ribosome entry site，IRES）的雙順反子真核表達載體。為了建立一種用于HBV基因治療的，以非病毒載體介導(dǎo)的肝細胞特異性IFNγ表達的基因遞送系統(tǒng)，我們利用上述HCV IRES，以pcDNA3.1載體為基礎(chǔ)，構(gòu)建以HBV S基因為靶基因，IFNγ基因為效應(yīng)基因的雙順反子真核表達載體。
　　方法:
　　根據(jù)既往研究中的方法，P

6、CR擴增出具有有效生物學(xué)活性的HCV IRES。然后，我們以pcDNA3.1載體為基礎(chǔ)，構(gòu)建雙順反子表達載體:在IRES位點的上游克隆HBsAg基因的部分反向序列和HCV全長核心蛋白(core protein)基因，在IRES位點下游克隆人IFNγ基因。這樣，在pcDNA3.1載體的巨細胞病毒(cytomegalovirus，CMV)啟動子下依次驅(qū)動部分HBV反義S基因(antisense Sgene)、HCV核心蛋白基因，下游是HCV

7、 IRES部分有效序列和IFNγ效應(yīng)基因，即HBV-anti S/HCV core-IRES-IFNγ載體系統(tǒng)，簡稱為pcDNA3.1-SCⅡ載體系統(tǒng)。當(dāng)細胞內(nèi)HBV表達HBsAg時，此載體中HBV S基因反義序列轉(zhuǎn)錄的mRNA，可以與HBV S基因的mRNA結(jié)合，也就在HCV核心蛋白基因起始密碼子AUG前形成mRNA二聚體，抑制了HCV核心蛋白的表達，從而解除了HCV核心蛋白對HCV IRES的制約，IRES啟動下游IFNγ基因表達增

8、強。這樣，受感染的肝細胞因表達HBsAg而自我同時表達IFNγ;而在正常無HBV S基因存在的細胞中，則不會介導(dǎo)IFNγ表達。
　　結(jié)果:
　　通過PCR或酶切含目的片段質(zhì)粒的方法獲得的pcDNA3.1-SCⅡ載體中的四個基因片段:HBV anti S，HCV core，HCV IRES和人IFNγ基因分別和T載體連接后，經(jīng)PCR、酶切及測序鑒定后證實，獲得的四個基因片段均與Genbank上登錄的序列有97％以上的同源性。通

9、過亞克隆最終構(gòu)建的pcDNA3.1-SCⅡ載體，經(jīng)雙酶切和測序鑒定表明，四個基因片段完全正確的插入了pcDNA3.1載體。
　　結(jié)論:
　　經(jīng)酶切和測序初步鑒定，成功構(gòu)建了pcDNA3.1-SCⅡ載體。
　　第二部分體外實驗分析pcDNA3.1-SCⅡ載體中效應(yīng)基因人IFN-γ的細胞特異性表達
　　目的:
　　觀察構(gòu)建的pcDNA3.1-SCⅡ載體能否有效介導(dǎo)表達HBsAg的肝細胞特異性的人IFN-γ表達。

10、
　　方法:
　　(1)用雙酶切pEGFP-N1質(zhì)粒獲得的編碼綠色熒光蛋白(green fluorescentprotein，GFP)的GFP基因替換pcDNA3.1-SCⅡ中的人IFN-γ基因，構(gòu)建出質(zhì)粒pcDNA3.1-SCIGFP。用脂質(zhì)體2000體外轉(zhuǎn)染試劑將質(zhì)粒pcDNA3.1-SCIGFP分別瞬時轉(zhuǎn)染HepG2和HepG2.2.15細胞。轉(zhuǎn)染48h后，熒光顯微鏡下觀察GFP的表達。同時構(gòu)建了pcDNA3.1-GF

11、P質(zhì)粒，分別瞬時轉(zhuǎn)染兩種細胞后，熒光顯微鏡下觀察GFP表達，判斷pcDNA3.1介導(dǎo)的重組載體在兩種細胞中轉(zhuǎn)染效率。(2)用同樣方法將不同質(zhì)量（4μg、8μg和16μg）的pcDNA3.1-SCⅡ載體分別轉(zhuǎn)染HepG2和HepG2.2.15細胞。在轉(zhuǎn)染后24h、48h、72h和96h的4個不同時間點，ELISA檢測兩種細胞培養(yǎng)上清中IFN-γ的含量。轉(zhuǎn)染72h后，采用逆轉(zhuǎn)錄PCR(reverse transcription PCR, R

12、T-PCR)法檢測兩種細胞中人IFN-γ在mRNA水平的表達。同時在轉(zhuǎn)染后72h，Western blot檢測兩種細胞內(nèi)IFN-γ蛋白的表達。(3)轉(zhuǎn)染72h后，用RT-PCR法檢測轉(zhuǎn)染了8μg陰性對照質(zhì)粒pcDNA3.1-SCIGFP及8μg pcDNA3.1-SCⅡ質(zhì)粒的HepG2.2.15細胞內(nèi)HBV S基因mRNA水平，以未轉(zhuǎn)染質(zhì)粒的HepG2.2.15細胞和轉(zhuǎn)染了相同質(zhì)量空白pcDNA3.1載體的HepG2.2.15細胞做對照

13、，觀察構(gòu)建的pcDNA3.1介導(dǎo)的載體系統(tǒng)(pcDNA3.1-SCIGFP和pcDNA3.1-SCⅡ)對靶基因HBV S基因在mRNA水平的抑制作用。
　　結(jié)果:
　　(1)在相同的轉(zhuǎn)染效率下，轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-SCIGFP后可導(dǎo)致GFP在HepG2.2.15細胞中的高表達，而在HepG2細胞中幾乎沒有表達。(2)轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-SCⅡ72h后，Western blot結(jié)果顯示在不同的轉(zhuǎn)染劑量下，IFN-γ在Hep

14、G2.2.15細胞內(nèi)均呈陽性表達，而在HepG2細胞內(nèi)均未檢測到有效表達;RT-PCR結(jié)果顯示，IFN-γ在mRNA水平的表達也得到一致的結(jié)果，并且其mRNA表達量隨pcDNA3.1-SCⅡ轉(zhuǎn)染劑量的增加而增加。ELISA檢測兩種細胞上清中IFN-γ的表達得到的結(jié)果表明，在不同劑量和不同時間點下，IFN-γ在HepG2.2.15細胞上清中有效表達，而在HepG2細胞上清中表達水平很低。IFN-γ在HepG2.2.15細胞上清中的表達也具

15、有劑量效應(yīng)，同時IFN-γ的表達量在轉(zhuǎn)染后48h達到最高，在轉(zhuǎn)染后96h仍未見明顯下降。(3) RT-PCR檢測HepG2.2.15細胞內(nèi)HBV S基因結(jié)果顯示，pcDNA3.1介導(dǎo)的載體系統(tǒng)（pcDNA3.1-SCIGFP和pcDNA3.1-SCⅡ）能夠有效抑制編碼HBsAg的S基因mRNA表達水平。
　　結(jié)論:
　　體外實驗表明，pcDNA3.1-SCⅡ載體能夠使外源基因有效的在表達HBsAg的肝細胞中特異性表達，并能有

16、效抑制靶基因即編碼HBsAg的S基因mRNA表達水平。
　　第三部分 pcDNA3.1-SCⅡ載體體外抑制乙肝病毒復(fù)制與表達的研究
　　目的:
　　以HepG2.2.15細胞為靶細胞，觀察不同質(zhì)量pcDNA3.1-SCⅡ轉(zhuǎn)染細胞后，在不同時間pcDNA3.1-SCⅡ?qū)毎鸋BV基因復(fù)制和表達的作用，并觀察pcDNA3.1-SCⅡ?qū)毎蛲龅挠绊憽?br>　　方法:
　　將不同質(zhì)量（4μg、8μg和16μg）的pc

17、DNA3.1-SCⅡ載體用脂質(zhì)體瞬時轉(zhuǎn)染HepG2.2.15細胞，在轉(zhuǎn)染后24h、48h、72h和96h的4個不同時間點，用ELISA法檢測細胞分泌上清中HBsAg和HBV e抗原(hepatitis B virus e antigen，HBeAg)含量;用熒光定量PCR(fluorescent quantitative PCR，F(xiàn)Q-PCR)方法檢測細胞分泌上清中HBV DNA含量;以上實驗，均用未轉(zhuǎn)染的HepG2.2.15細胞作空白

18、對照、轉(zhuǎn)染了陰性對照質(zhì)粒(pcDNA3.1-SCIGFP)的HepG2.2.15細胞作為陰性對照及用10μmol/l拉米夫定處理的HepG2.2.15細胞作陽性對照，觀察pcDNA3.1-SCⅡ?qū)毎锨逯蠬BV復(fù)制與表達的影響，并觀察pcDNA3.1-SCⅡ作用的劑量-效應(yīng)關(guān)系。在轉(zhuǎn)染48h后，用Southern blot法檢測細胞內(nèi)HBV DNA復(fù)制中間體的含量;觀察pcDNA3.1-SCⅡ?qū)毎麅?nèi)HBV復(fù)制的影響。在轉(zhuǎn)染96h后，

19、用Annexin V-FITC/PI法和流式細胞儀檢測細胞凋亡，觀察pcDNA3.1-SCⅡ?qū)毎蛲龅挠绊?。用拉米夫定處理的HepG2.2.15細胞組作陽性對照，未轉(zhuǎn)染的HepG2.2.15細胞作陰性對照。
　　結(jié)果:
　　在轉(zhuǎn)染后4天里，不同質(zhì)量的pcDNA3.1-SCⅡ與未轉(zhuǎn)染細胞對照組相比均能顯著降低細胞培養(yǎng)上清中HBsAg、 HBeAg和HBV DNA的含量，且隨著轉(zhuǎn)染質(zhì)量的增加，其抑制作用也隨之增強(P＜0.05

20、);而轉(zhuǎn)染了陰性對照質(zhì)粒對照組與未轉(zhuǎn)染細胞對照組相比無顯著性差異(P＞0.05)。拉米夫定對細胞上清中HBVDNA抑制作用較強，但其抑制作用在第四天顯著下降，而pcDNA3.1-SCⅡ在第四天仍表現(xiàn)出較強的抑制HBV DNA作用;拉米夫定對細胞上清中HBsAg和HBeAg抑制作用較弱，其對HBeAg抑制作用介于4μg和8μg pcDNA3.1-SCⅡ?qū)BeAg的抑制作用之間、其對HBsAg抑制作用更弱，低于4μg pcDNA3.1-S

21、CⅡ?qū)BsAg的抑制作用。Southern blot法檢測也表明pcDNA3.1-SCⅡ能夠有效抑制HepG2.2.15細胞中HBV復(fù)制中間體含量，并且這種抑制作用也存在劑量-效應(yīng)關(guān)系。我們觀察到pcDNA3.1-SCⅡ?qū)毎锨逯蠬BsAg、 HBeAg和HBVDNA的抑制作用在轉(zhuǎn)染后48h達到最強，并且pcDNA3.1-SCⅡ?qū)BsAg的抑制作用比其對HBeAg和HBV DNA的抑制作用強。在細胞凋亡實驗中，與陰性對照組相比，拉