重組人血管內(nèi)皮抑素的心臟毒性及其機(jī)制研究.pdf

1、背景與目的： 1971年哈佛大學(xué)醫(yī)學(xué)院Folkman教授首先提出“腫瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移依賴于新生血管生成，阻斷血管生成是遏制腫瘤生長(zhǎng)的有效策略”的理論，由此開創(chuàng)了腫瘤抗血管生成治療的研究。近年來，針對(duì)腫瘤新生血管這個(gè)靶點(diǎn)新的抗癌藥物(如貝伐單抗、索拉非尼、舒尼替尼)已經(jīng)從實(shí)驗(yàn)室走向臨床應(yīng)用，并取得了良好的療效。除此之外，做為廣譜內(nèi)源性血管生長(zhǎng)抑制因子-內(nèi)皮抑素(Endostatin)在小鼠體內(nèi)可使93～97％腫瘤停止生長(zhǎng)，成為全球最引

2、人注目的抗血管生成藥物。然而在以后臨床應(yīng)用中卻發(fā)現(xiàn)Endostatin在人體內(nèi)活性很低，科學(xué)家無法攻克蛋白質(zhì)復(fù)性的技術(shù)難關(guān)，生產(chǎn)成本過高無法實(shí)現(xiàn)Endostatin的大規(guī)模生產(chǎn)。我國學(xué)者羅永章等經(jīng)過長(zhǎng)期不懈的努力，解決該蛋白復(fù)性的技術(shù)難關(guān)，創(chuàng)造的改變了Endostatin的氨基酸序列，使該蛋白的藥用性能和療效得到了顯著提高。就是這個(gè)我國自主研發(fā)的新型重組人血管內(nèi)皮抑素(Recombinanthumanendostatin，rh-Endo

3、statin，Endostar，恩度)，于2005年9月獲得了國家食品藥品監(jiān)督管理局頒發(fā)的生物制品一類新藥證書，它是世界上首例血管內(nèi)皮抑制素抗癌新藥。2006年7月恩度在我國上市開始臨床使用，對(duì)晚期肺癌的治療顯示出較好的療效。 據(jù)恩度治療說明書描述，I～I(xiàn)II期臨床試驗(yàn)安全性評(píng)價(jià)指出，470例受試晚期非小細(xì)胞肺癌患者中有30例(6.38％)出現(xiàn)了心臟不良反應(yīng)。既往研究多集中于葸環(huán)類藥物或放療所致的心臟毒性，然而，隨著分子靶向藥物

4、臨床逐漸廣泛，越來越多的分子靶向藥物心血管不良反應(yīng)逐漸被發(fā)現(xiàn)并受到研究者重視，有關(guān)心臟毒性的研究熱點(diǎn)也轉(zhuǎn)向了分子靶向藥物，其發(fā)生機(jī)制也有了初步的研究。研究表明單獨(dú)使用曲妥珠單抗，有4-7％發(fā)生心功能不全，尤其是充血性心衰(GHF)和左室射血分?jǐn)?shù)(LVEF)的減少，發(fā)生機(jī)制可能與心臟組織上的HER-2受體的分化和存活有關(guān)。NatureMedicine一篇文章指出，伊馬替尼可能增加化療患者發(fā)生心力衰竭的風(fēng)險(xiǎn)，研究者推測(cè)，伊馬替尼可能是通過抑

5、制心肌細(xì)胞上的ABL激酶，并影響細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)合成，從而導(dǎo)致了對(duì)心肌細(xì)胞的損傷。舒尼替尼也有心臟毒性的報(bào)道。 盡管臨床前試驗(yàn)認(rèn)為恩度心臟毒性不是十分嚴(yán)重，然而使用過程中出現(xiàn)了左心衰嚴(yán)重不良心血管事件。心臟的副作用是恩度最常見并且是最有可能危及生命的毒副反應(yīng)，因此，有必要對(duì)恩度心臟毒性的嚴(yán)重程度再次評(píng)價(jià)，篩選臨床早期診斷和預(yù)測(cè)的指標(biāo)。從長(zhǎng)遠(yuǎn)上考慮，對(duì)于心臟毒性的了解越深入越利于新藥的國際推廣應(yīng)用。研究表明分子靶向藥物的心臟毒性機(jī)制不

6、同于蒽環(huán)類藥物，前者心臟毒性多與藥物作用的靶點(diǎn)密切相關(guān)，并且信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路參與心臟毒性的機(jī)制。研究者也認(rèn)為每種分子靶向藥物的心臟毒性機(jī)制都不完全相同，故關(guān)于恩度發(fā)生心臟毒性的機(jī)制需要深入研究。 基于上述理論，本研究試圖從臨床觀察和實(shí)驗(yàn)研究?jī)煞矫嬖u(píng)價(jià)rh-Endostatin的心臟毒性，篩選早期診斷和預(yù)測(cè)臨床指標(biāo)，并初步探討其心臟損傷的可能機(jī)理。 方法： 1.將既往使用恩度聯(lián)合化療的11例晚期腫瘤患者的資料進(jìn)行回顧性

7、分析，包括治療過程中有無心慌、胸悶、呼吸困難等臨床癥狀及癥狀發(fā)生時(shí)間，治療前后心電圖(ECG)，心肌酶譜及LVEF的改變，評(píng)價(jià)恩度心臟毒性，并初步篩選心臟毒性早期診斷臨床指標(biāo)。 2.為客觀評(píng)價(jià)心臟毒性以及全面篩選心臟毒性早期臨床診斷指標(biāo)，設(shè)計(jì)了前瞻性臨床實(shí)驗(yàn)，選擇恩度聯(lián)合化療18例，單純化療12例為對(duì)照研究，每周期用藥的d0、d15檢測(cè)ECG、INEF、CK-MB、cTnT和NT-proBNP等多項(xiàng)指標(biāo)。 3.24只實(shí)驗(yàn)

8、大鼠隨機(jī)分成4組，每組6只。對(duì)照組以等體積生理鹽水腹腔注射，rh-Endostatin低、中、高三個(gè)劑量組，分別給與3mg/kg、6mg/kg、12mg/kg腹腔注射，每日一次，每組各半大鼠(3只)分別給藥4周和8周時(shí)間，均在末次給藥后24h殺死。HE染色各組大鼠心肌組織，光鏡下觀察病理形態(tài)學(xué)改變；透射電鏡觀察大鼠心肌組織超微結(jié)構(gòu)的病理改變；通過TUNEL方法檢測(cè)大鼠心肌細(xì)胞凋亡；通過CD34來標(biāo)記內(nèi)皮細(xì)胞進(jìn)行免疫組織化學(xué)檢測(cè)，檢測(cè)大鼠

9、心肌組織的微血管密度改變。 4.分別以100μg/ml、200μg/ml、400μg/ml三個(gè)不同劑量的rh-Endostatin處理H9c2心肌細(xì)胞24h、48h，不加藥物作為對(duì)照組，通過AnnexinV/PI雙染流式細(xì)胞儀檢測(cè)心肌細(xì)胞凋亡率。400μg/mlrh-Endostatin處理H9c2心肌細(xì)胞24h，不加藥物作為對(duì)照組，透射電鏡觀察心肌細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的改變。400μg/mlrh-Endostatin處理H9c2心肌細(xì)

10、胞，不加藥物作為對(duì)照組，瓊脂糖凝膠電泳DNALaddering方法檢測(cè)細(xì)胞凋亡。 5.體外培養(yǎng)H9c2心肌細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞凋亡的發(fā)生機(jī)制研究。以100μg/ml、200μg/ml、400μg/mlrh-Endostatin三個(gè)不同劑量和不加藥物對(duì)照組進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究，通過共聚焦顯微鏡檢測(cè)心肌線粒體膜電位變化，細(xì)胞免疫化學(xué)方法進(jìn)行細(xì)胞色素C釋放實(shí)驗(yàn)、化學(xué)發(fā)光法測(cè)心肌細(xì)胞胞內(nèi)ADP與ATP比值的改變。400μg/mlrh-Endostati

11、n處理H9c2心肌細(xì)胞14h、28h，不加藥物為對(duì)照組，WesternBlotting方法檢測(cè)p-JNK和p-eIf2α的表達(dá)水平，研究rh-Endostatin產(chǎn)生細(xì)胞凋亡的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制。通過免疫熒光方法細(xì)胞定位檢測(cè)H9c2心肌細(xì)胞核仁素的表達(dá)，初步探討rh-Endostatin的心肌毒性作用受體。 結(jié)論： 1.初步顯示重組人血管內(nèi)皮抑素聯(lián)合化療存在輕度的心臟不良反應(yīng)，對(duì)心肌有一定的損傷，但是短期內(nèi)心功能未受到明顯改變

12、。CK-MB和心電圖可作為早期監(jiān)測(cè)心臟毒性的檢查指標(biāo)。在重組人血管內(nèi)皮抑素聯(lián)合化療的過程中應(yīng)該警惕心臟不良反應(yīng)的發(fā)生。 2.心電圖以及CK-MB、cTnT和NT-proBNP可作為早期監(jiān)測(cè)心臟毒性的臨床指標(biāo)。CK-MB、cTnT和NT-proBNP三種心肌生化標(biāo)志物聯(lián)合檢測(cè)，有助于提高預(yù)測(cè)rh-Endostatin心肌損傷的敏感性和準(zhǔn)確性。 3.高劑量的rh-Endostatin對(duì)大鼠心肌有明顯病理改變，并觀察到超微結(jié)構(gòu)

13、的損傷，TUNEL方法也觀察到高劑量組大鼠心肌組織凋亡細(xì)胞增多，提示心肌細(xì)胞凋亡機(jī)制參與了rh-Endostatin心臟毒性的病理過程。 4.體外實(shí)驗(yàn)從細(xì)胞的形態(tài)學(xué)和生化特征證實(shí)了rh-Endostatin對(duì)H9c2心肌細(xì)胞有凋亡作用，推測(cè)心肌細(xì)胞凋亡可能是導(dǎo)致心臟毒性的重要原因。 5.Rh-Endostatin對(duì)心肌細(xì)胞的毒性機(jī)制是因于rh-Endostatin激活了線粒體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激兩條凋亡途徑，造成了心肌細(xì)胞的凋亡