重組人血管內(nèi)皮抑素治療惡性漿膜腔積液的基礎(chǔ)與臨床應(yīng)用研究.pdf

1、目的：觀察、探究重組人血管內(nèi)皮抑素（rh-Endostatin，商品名稱：恩度，英文名稱：Endostar，研發(fā)代號(hào)：YH-16）治療惡性漿膜腔積液的作用機(jī)制，評(píng)價(jià)Endostar漿膜腔內(nèi)灌注治療惡性漿膜腔積液的臨床療效和應(yīng)用安全性。
　　方法：本實(shí)驗(yàn)研究選擇 BALB/C小鼠，采用 H22肝癌腹水瘤細(xì)胞株腹腔內(nèi)注射建立H22腹水瘤實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ汀?br>　?。?）Endostar對(duì)荷H22腹水瘤小鼠作用的實(shí)驗(yàn) Endostar對(duì)荷H2

2、2腹水瘤小鼠作用的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組：180只小鼠隨機(jī)分為6組，每組30只，Ⅰ組：陰性對(duì)照組（0.9％氯化鈉，0.2ml）；Ⅱ組：陽性對(duì)照組（順鉑1mg/kg）；Ⅲ組：低劑量治療組（Endostar5mg/kg）；Ⅳ組：中劑量治療組（Endostar10mg/kg）；Ⅴ組:高劑量治療組（Endostar15mg/kg）；Ⅵ組:聯(lián)合治療組（順鉑1mg/kg+中劑量Endostar10mg/kg）。腹腔內(nèi)隔日注射用藥，共3次，每次給藥前處死6只。

3、觀察小鼠一般情況，記錄小鼠體重變化，存活狀況，計(jì)算存活率，繪制生存曲線，收集腹水及血液，酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）檢測(cè)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）的濃度。
　?。?）Endostar對(duì)荷H22腹水瘤小鼠腹膜微血管形態(tài)研究60只小鼠分6組，每組10只。分組同實(shí)驗(yàn)（1）。小鼠腹腔積液長(zhǎng)出后經(jīng)超聲檢查確認(rèn)，各組均隔日腹腔藥物注射，調(diào)整藥物濃度，總共給藥3次。停藥1天后處死小鼠。腹膜標(biāo)本光鏡HE染色，觀察腹膜血管及細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化。比較生

4、理鹽水、順鉑及中劑量Endostar組腹膜微血管密度。電鏡觀察腹膜形態(tài)學(xué)變化。
　　（3）Endostar對(duì)荷H22腹水瘤小鼠腹膜微血管生物因子檢測(cè)40只小鼠分2組，中劑量連續(xù)給藥組（連續(xù)組）和中劑量隔2日給藥組（隔2日組）各20只；實(shí)驗(yàn)采用中劑量組10.00mg/kg給藥，連續(xù)組d7，d8，d9，d10，d11，d12給藥，隔2日組分別于d7，d10給藥。均在d7，d13處死小鼠各10只。采用ELISA法和SP法分別檢測(cè)腹水、腹

5、膜組織中VEGF、基質(zhì)金屬蛋白酶-2（MMP-2）、MMP-9、缺氧誘導(dǎo)因子-1α（HIF-1α）、存活素（Survivin）、Caspase-3、Caspase-9、B細(xì)胞淋巴瘤/白血病-2基因（Bcl-2）和Bcl-xl的表達(dá)。
　?。?）Endostar對(duì)荷H22腹水瘤小鼠腹膜微血管機(jī)制研究78只小鼠共分為4組，中劑量給藥，連續(xù)組（2a）：d7，d8，d9，d10，d11，d12；隔日組（2b）：d7，d9，d11；隔2日組

6、（2c）：d7，d10；每周組（2d）：d7；連續(xù)組、隔日組分別于d7，d9，d11，d13處死小鼠每組6只，隔2日組于d7，d10，d13；每周組于d7，d13處死小鼠。對(duì)實(shí)驗(yàn)腹膜組織分別進(jìn)行Real-Time PCR檢測(cè)MMP-2、VEGF和Survivin的mRNA，蛋白印跡法（Western blot）檢測(cè)腹膜蛋白表達(dá)水平。
　?。?）Endostar對(duì)惡性漿膜腔積液患者的區(qū)域灌注治療的臨床觀察晚期惡性腫瘤合并漿膜腔積液的

7、患者共60例，隨機(jī)分組，分為Endostar腔內(nèi)單藥灌注治療組（單藥組）31例，Endostar與順鉑聯(lián)合局部灌注治療組（聯(lián)合組）29例。超聲定位，“豬尾巴”導(dǎo)管積液腔內(nèi)穿刺導(dǎo)管留置術(shù)，盡可能放盡積液，單藥組由導(dǎo)管注入Endostar行局部區(qū)域灌注治療。胸腔積液或心包腔積液患者，Endostar單次注入30mg；腹腔積液患者，Endostar單次注入45mg，隔日1次，連續(xù)使用1-2周時(shí)間，視積液情況，每周1～2次維持。聯(lián)合治療組在單藥

8、基礎(chǔ)上聯(lián)合加用順鉑化療（聯(lián)合組），順鉑劑量30～40mg/m2。RECIST1.1“不可測(cè)量病灶”療效評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)，計(jì)算臨床獲益率（DCR），評(píng)價(jià)生活質(zhì)量（QOL）以及NCI CTC3.0版標(biāo)準(zhǔn)評(píng)價(jià)毒副反應(yīng)。
　　結(jié)果：
　?。?）Endostar對(duì)荷H22腹水瘤小鼠作用荷H22腹水瘤小鼠腹水出現(xiàn)前（第1-6天），小鼠進(jìn)食、飲水、活動(dòng)以及排便等一般情況均良好；接種后約第6-7天開始，生理鹽水陰性對(duì)照組小鼠體重迅速增加；第9-10

9、天開始，荷瘤小鼠逐漸出現(xiàn)精神萎靡、呆滯少動(dòng)，活動(dòng)遲緩、反應(yīng)性差、食欲降低、糞便干燥等，腹水增長(zhǎng)速度高于各用藥組；第11-12天開始，小鼠晚期呆滯少動(dòng)，腹部極度膨隆，呈惡液質(zhì)狀態(tài)；第12天對(duì)照組小鼠全部死亡；Endostar與順鉑聯(lián)合組體重增加較慢，精神較好，中位生存期為17天。Endostar對(duì)荷H22腹水瘤小鼠腹水的抑制作用顯示：實(shí)驗(yàn)第9天，Endostar各劑量組及Ⅱ組較Ⅰ組出現(xiàn)的腹水量減少，荷瘤小鼠體重差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但是End

10、ostar各劑量組較Ⅱ組無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；第11天，Endostar各劑量組較Ⅰ組、Ⅱ組荷瘤小鼠有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；Endostar各劑量組間比較Ⅳ組較Ⅲ、Ⅴ組荷瘤小鼠體重差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；第13天，各組荷瘤小鼠的體重均發(fā)生了顯著的變化，組間比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；第9天、第11天、第13天Ⅵ組較Ⅰ組出現(xiàn)的腹水量少，荷瘤小鼠體重差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；較Ⅱ組有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；較Endostar各劑量組荷瘤小鼠體重差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。Endostar對(duì)荷H22腹水

11、瘤小鼠生存時(shí)間的影響顯示：Ⅰ組中位生存時(shí)間為10.54士0.32天，時(shí)間最短；Ⅵ組最長(zhǎng)，為17.01士0.31天，Endostar不同劑量組荷瘤小鼠的生存時(shí)間較對(duì)照組延長(zhǎng)，差異顯著；Endostar各劑量組間比較Ⅳ組較Ⅲ組生存時(shí)間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；Ⅵ組較Ⅰ組、Ⅱ組、及Endostar各劑量組生存時(shí)間延長(zhǎng)。Endostar對(duì)荷H22腹水瘤小鼠腹水及血清中VEGF表達(dá)的影響：實(shí)驗(yàn)第9天Endostar各劑量組腹水及血清中的VEGF較Ⅰ組有統(tǒng)

12、計(jì)意義；Endostar各劑量組間比較Ⅳ組腹水、血清中VEGF數(shù)值較Ⅲ、Ⅴ組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；第11天各組間比較荷瘤小鼠腹水中VEGF數(shù)值下降明顯，均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；荷瘤小鼠血清中VEGF表達(dá)，在Ⅳ組、Ⅴ組較Ⅱ組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；Endostar各劑量組間比較血清VEGF數(shù)值有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；第9天、第11天Ⅵ組腹水及血清中VEGF表達(dá)較Ⅰ組、Ⅱ組、Endostar各劑量組下降均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　（2）Endostar對(duì)荷H22腹水

13、瘤小鼠腹膜微血管形態(tài)學(xué)的影響觀察各組荷瘤小鼠腹膜和腹腔臟器表面未見有明顯的種植轉(zhuǎn)移瘤、轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)形成；腹膜光鏡檢查各用藥組腹膜血管及細(xì)胞形態(tài)未見明顯差異，用藥組未見大片細(xì)胞壞死及間質(zhì)血管減少現(xiàn)象。腹膜微血管密度（MVD）檢測(cè)中劑量Endostar組為13.96±0.59，與順鉑組14.24±0.40及生理鹽水對(duì)照組14.36±0.57比較，其MVD絕對(duì)數(shù)值稍有降低，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。腹膜的電鏡觀察顯示，生理鹽水組腹膜毛細(xì)血管的通透性明顯增強(qiáng)

14、，毛細(xì)血管完全由單層血管內(nèi)皮細(xì)胞連接而形成，細(xì)胞基底膜結(jié)構(gòu)破壞，毛細(xì)血管壁極薄，細(xì)胞之間連接較疏松，并可見大量線粒體水腫、空泡化現(xiàn)象；3個(gè)不同劑量的Endostar組可見腹膜毛細(xì)血管壁增厚，部分趨于正常；細(xì)胞間緊密連接，縫隙連接較多；線粒體水腫明顯減輕，并可見較多正常線粒體。提示Endostar可以減輕微血管損傷，使之趨于正?；ｍ樸K組小鼠腹膜毛細(xì)血管壁較薄，細(xì)胞基底膜損傷較重；細(xì)胞之間連接較疏松以及因小鼠生存時(shí)間延長(zhǎng)導(dǎo)致線粒體出現(xiàn)代償

15、最終轉(zhuǎn)化為線粒體水腫數(shù)量明顯增多的現(xiàn)象；聯(lián)合治療組腹膜毛細(xì)血管壁明顯增厚；細(xì)胞之間連接緊密以及線粒體基本正常等血管正常化改變。
　　（3）Endostar對(duì)荷H22腹水瘤小鼠腹膜微血管生物因子檢測(cè)結(jié)果荷瘤鼠惡性腹腔積液中VEGF、MMP-2、MMP-9、Survivin、Caspase-3、Caspase-9、HIF-1α和Bcl-2等8個(gè)指標(biāo)在藥物干預(yù)前水平明顯高于治療后，經(jīng)過Endostar干預(yù)治療后，各指標(biāo)出現(xiàn)明顯的下降，即

16、Endostar可以明顯下調(diào)上述8個(gè)生物因子在腹腔積液中的表達(dá)水平。在治療方式比較上，隔2日給藥組腹水中VEGF、MMP-2、MMP-9、Survivin、Caspase-3、Caspase-9、HIF-1α和Bcl-2表達(dá)水平下降的幅度更低，組間比較具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。在對(duì)腹膜組織的組化染色比較上，也出現(xiàn)了與腹水ELISA檢測(cè)相似的研究結(jié)果。
　?。?）Endostar對(duì)荷H22腹水瘤小鼠腹膜微血管機(jī)制中劑量Endostar采用不同

17、給藥時(shí)間方式對(duì)荷瘤小鼠腹膜組織中MMP-2、VEGF和Survivin的mRNA水平檢測(cè)以及蛋白表達(dá)水平的研究。Endostar采用連續(xù)給藥、隔日給藥、隔2給藥和每周給藥對(duì)荷瘤小鼠腹膜組織中MMP-2 mRNA、VEGF mRNA和Survivin mRNA的相對(duì)表達(dá)的影響顯示，其相對(duì)表達(dá)明顯下降，并具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。提示Endostar可以顯著的下調(diào)荷瘤鼠腹膜組織中MMP-2、VEGF和Survivin的mRNA表達(dá)，分析比較中劑量En

18、dostar應(yīng)用各組的抑制、下調(diào)水平，提示隔2日組給藥對(duì)MMP-2 mRNA、VEGF mRNA和Survivin mRNA的相對(duì)表達(dá)量的下調(diào)作用效果最優(yōu)，分別顯著強(qiáng)于連續(xù)、每周及隔日給藥組，差異顯著。提示，隔2日給藥組治療效果最佳。此研究趨勢(shì)在MMP-2、VEGF和Survivin蛋白表達(dá)的研究中其總體趨勢(shì)相近，但Endostar連續(xù)給藥組對(duì)MMP-2、VEGF和Survivin的蛋白下調(diào)效應(yīng)明顯優(yōu)于隔日給藥、隔2日以及每周給藥組，具

19、有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示連續(xù)給藥方式具有較大的治療優(yōu)勢(shì)和治療效應(yīng)；中劑量Endostar隔日、隔2日給藥作用效應(yīng)相近，未見組間差異，但兩組的作用效應(yīng)均優(yōu)于每周給藥治療組，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　?。?）Endostar對(duì)惡性漿膜腔積液患者的區(qū)域灌注治療的臨床觀察全組平均完成2.27個(gè)治療周期，平均治療持續(xù)時(shí)間為56.7天?；颊咧委燀樌?，耐受性滿意，未見有因?yàn)樗幬镄圆涣挤磻?yīng)而退出臨床治療患者?；颊呓诏熜В篊R：10.00%，NCR/NPD：

20、58.33%，PD：31.67%，DCR：68.33%，亞組分析，單藥組合聯(lián)合組各指標(biāo)分別為：6.45%、54.84%、38.71%、61.29%和19.77%、62.07%、24.14%、75.86%，其聯(lián)合組CR、NCR/NPD和DCR等指標(biāo)絕對(duì)值均明顯優(yōu)于單藥組，但兩組間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。全組患者治療后QOL均有不同程度的改善，單藥治療組QOL改善者17例，占54.84%；QOL穩(wěn)定者8例，占25.80%；QOL降低者6例，占19.3

21、5%。聯(lián)合化療組各指標(biāo)對(duì)應(yīng)為18例，占62.07%；6例，占20.69%；5例，占17.24%。組間比較未見明顯差異?；颊咧委熤谐霈F(xiàn)的Ⅲ+Ⅳ度毒副反應(yīng)主要出現(xiàn)在聯(lián)合治療組患者中，單藥組未見發(fā)生。
　　結(jié)論：
　　（1）Endostar具有抑制小鼠惡性腹腔積液的生成和延長(zhǎng)荷瘤小鼠生存期的作用，中劑量組較其他單藥劑量組顯示較好的效果，Endostar和順鉑聯(lián)合應(yīng)用具有明顯的協(xié)同作用；
　?。?）Endostar通過下調(diào)荷瘤

22、小鼠腹腔積液中VEGF的產(chǎn)生和表達(dá)阻斷血管生成，抑制惡性腹腔積液的形成，此效應(yīng)在Endostar中劑量應(yīng)用組中表現(xiàn)更優(yōu)，并可能與順鉑聯(lián)合應(yīng)用具有明顯的協(xié)同作用。
　?。?）Endostar具有降低荷瘤鼠腹膜微血管密度絕對(duì)值的效應(yīng)，改善腹腔積液腹膜微血管超微結(jié)構(gòu)的效應(yīng)，降低膜血管通透性，修復(fù)細(xì)胞基底膜的損害結(jié)構(gòu)，細(xì)胞間連接緊密，改善線粒體水腫、空泡化狀態(tài)，引發(fā)線粒體代償性增多，促進(jìn)血管正?；?。此效應(yīng)在Endostar與順鉑聯(lián)合給藥中

23、更加明顯。
　?。?）Endostar可能通過降低腹腔積液及腹膜組織中VEGF、MMP-2、MMP-9、Survivin、Caspase-3、Caspase-9、HIF-1α和Bcl-2等腫瘤相關(guān)因子的表達(dá)，降低血管通透性，保持基底膜完整性，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，改善腫瘤缺氧微環(huán)境，抑制惡性漿膜腔積液的生成。此效應(yīng)與不同給藥方法之間具有一定的差異。
　　（5）Endostar可以顯著的降低荷瘤鼠腹膜組織中MMP-2、VEGF和S