新型重組人血管內(nèi)皮抑素聯(lián)合欖香烯注射液治療惡性腹水的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、研究背景和目的：
　　 惡性腹腔積液（簡(jiǎn)稱惡性腹水）是臨床常見的腫瘤終末期事件，它嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量和生存時(shí)間，目前的常規(guī)治療雖然一定程度上可以緩解癥狀，但是具有明顯的局限性，遠(yuǎn)期療效不盡人意，因而急需探索治療惡性腹水的新藥物、新手段。業(yè)已證實(shí)，腹膜微血管通透性增加和腫瘤新生血管形成是惡性腹水形成的重要原因，血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)是刺激血管生成和增加血管滲透性的關(guān)鍵因子，通過干預(yù)相關(guān)環(huán)節(jié)，有望為治療惡性腹水提供新的途徑

2、。新型重組人血管內(nèi)皮抑素——恩度(rh-Endastatin，Endostar(R))，是一種內(nèi)源性的血管形成抑制因子，通過多靶點(diǎn)的抗血管生成作用抑制腫瘤的生長(zhǎng)。欖香烯注射液（以下簡(jiǎn)稱欖香烯）是從中藥莪術(shù)中提取的萜烯類抗腫瘤制劑，臨床上廣泛用于治療多種惡性腫瘤以及腔內(nèi)給藥治療惡性胸腹水。因此，本實(shí)驗(yàn)旨在探討恩度聯(lián)合欖香烯治療小鼠惡性腹水是否可以起到協(xié)同增效作用，并進(jìn)一步研究其作用機(jī)制，為恩度聯(lián)合欖香烯治療惡性腹水的臨床實(shí)踐提供可靠的實(shí)驗(yàn)

3、室依據(jù)。
　　 方法：
　　 1.體內(nèi)實(shí)驗(yàn):(1)在正常小鼠腹腔內(nèi)注射恩度和欖香烯，觀察兩藥聯(lián)合對(duì)小鼠體重的影響以及血液學(xué)和肝腎毒性。(2)腹腔內(nèi)接種H22腹水瘤細(xì)胞建立小鼠惡性腹水模型，分別用4mg/kg、8mg/kg和16mg/kg劑量的恩度以及50mg/kg、75mg/kg和100mg/kg劑量的欖香烯每天一次連續(xù)腹腔注射8天，觀察小鼠的平均腹水量和生存期，計(jì)算腹水抑制率，確定最佳單藥劑量。(3)分別采用兩藥不同劑

4、量的組合治療荷瘤小鼠，觀察小鼠的平均腹水量和生存期，計(jì)算腹水抑制率，確定最佳劑量組合。(4)用已確定的最佳劑量組合單獨(dú)或聯(lián)合治療荷瘤小鼠，分為4組，即對(duì)照組、恩度組、欖香烯組和兩藥聯(lián)合組，再一次觀察療效，并進(jìn)一步探討兩藥作用的機(jī)制:①計(jì)量各組小鼠的平均腹水量，根據(jù)藥物相互作用指數(shù)(CDI)判斷是否具有協(xié)同作用;②計(jì)數(shù)腹水中腫瘤細(xì)胞數(shù)和紅細(xì)胞數(shù);③檢測(cè)小鼠腹水和血清中蛋白和乳酸脫氫酶(LDH)的水平;④觀察各組小鼠的生存期并繪制生存曲線;

5、⑤透射電鏡觀察聯(lián)合組小鼠腹水中腫瘤細(xì)胞的亞細(xì)胞結(jié)構(gòu);⑥流式細(xì)胞儀檢測(cè)小鼠循環(huán)血內(nèi)皮細(xì)胞的變化;⑦腹膜滲透性檢測(cè):從荷瘤小鼠尾靜脈注射0.2ml5％的伊文藍(lán)溶液，2h后處死荷瘤小鼠收集腹水并檢測(cè)其在540nm波長(zhǎng)處伊文藍(lán)的吸光度，通過吸光度值間接反映伊文藍(lán)的濃度，從而分析荷瘤小鼠腹膜微血管滲透性;⑧ELISA法檢測(cè)各組荷瘤小鼠腹水中VEGF、MMP-2、CD44v6和HIF-1α的水平;⑨蛋白免疫印跡雜交技術(shù)(WesternBlot)檢測(cè)

6、各組荷瘤小鼠腹水中腫瘤細(xì)胞VEGF、MMP-2、p-p38MAPK和p38MAPK蛋白的表達(dá);⑩實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-qPCR)檢測(cè)各組荷瘤小鼠水中腫瘤細(xì)胞VEGFmRNA的表達(dá)。
　　 2.體外實(shí)驗(yàn):(1)CCK-8法測(cè)定不同濃度的恩度聯(lián)合不同濃度的欖香烯處理24h和48h后對(duì)H22細(xì)胞增殖的影響。(2)ELISA法檢測(cè)恩度、欖香烯單藥以及兩藥聯(lián)合處理48h后H22細(xì)胞上清液中VEGF、CD44V6、MMP-2和H

7、IF-1α的水平。(3)WesternBlot檢測(cè)恩度、欖香烯單藥以及兩藥聯(lián)合處理48h后H22細(xì)胞巾VEGF和MMP-2蛋白的表達(dá)。
　　 結(jié)果：
　　 1.體內(nèi)實(shí)驗(yàn):(1)恩度聯(lián)合欖香烯在正常小鼠腹腔內(nèi)連續(xù)腹腔注射8天后對(duì)小鼠的體重沒有明顯影響，也沒有觀察到血液學(xué)毒性以及肝腎毒性。(2)恩度最佳單藥劑量為8mg/kg，欖香烯最佳單藥劑量為100mg/kg。(3)聯(lián)合應(yīng)用時(shí)，最佳劑量組合為恩度8mg/kg聯(lián)合欖香烯10

8、0mg/kg。(4)模型組小鼠隨機(jī)分為4組:對(duì)照組（生理鹽水）、恩度組（8mg/kg）、欖香烯組(100mg/kg)和兩藥聯(lián)合組（恩度8mg/kg聯(lián)合欖香烯100mg/kg），每天一次連續(xù)腹腔內(nèi)注射8天后處死小鼠，行相關(guān)檢測(cè):①對(duì)照組、恩度組、欖香烯組和聯(lián)合組小鼠腹水量分別為8.93±0.79、7.34±0.76、4.79±0.47和3.12±0.23ml，計(jì)算得CDI值為0.79，兩藥聯(lián)合具有協(xié)同作用;②實(shí)驗(yàn)組均能抑制腹水中的腫瘤細(xì)胞

9、數(shù)，尤其以聯(lián)合組效果最佳；欖香烯對(duì)腹水中紅細(xì)胞無明顯影響，恩度和聯(lián)合組均能減少小鼠腹水中的紅細(xì)胞，但是這兩組之間差別沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；③恩度和欖香烯均可以降低腹水中蛋白和LDH的含量，聯(lián)合組效果更明顯；各實(shí)驗(yàn)組血清中蛋白和LDH水平無明顯差異；④對(duì)照組、恩度組、欖香烯組和聯(lián)合組小鼠中位生存期分別為11、14、15和18天，各實(shí)驗(yàn)組生存時(shí)間延長(zhǎng)率分別為34.74%、43.67%和66.67%;⑤透射電鏡觀察聯(lián)合組腹水瘤細(xì)胞有明顯的凋亡，細(xì)胞

10、壞死嚴(yán)重；⑥對(duì)照組、恩度組、欖香烯組和聯(lián)合組小鼠循環(huán)血中活的內(nèi)皮細(xì)胞占外周有核細(xì)胞的百分比(%)分別為6.82±0.91、1.95±0.17、6.16±0.42和0.57±0.09;⑦對(duì)照組、恩度組、欖香烯組和聯(lián)合組小鼠腹水光吸收值（OD值）分別為1.71±0.13、1.45±0.09、1.05±0.08和0.88±0.07;⑧ELISA檢測(cè)顯示聯(lián)合組較恩度和欖香烯單藥進(jìn)一步下調(diào)了小鼠腹水中VEGF、CD44V6、MMP-2和HIF-1

11、α等細(xì)胞因子的水平;⑨聯(lián)合組增強(qiáng)了恩度和欖香烯單藥對(duì)小鼠腹水瘤細(xì)胞中VEGF和MMP-2的抑制；雖然欖香烯對(duì)p38MAPK信號(hào)通路沒有明顯影響，但是它增強(qiáng)了恩度對(duì)p38MAPK蛋白磷酸化的抑制作用；⑩對(duì)照組、恩度組、欖香烯組和聯(lián)合組VEGFmRNA的相對(duì)表達(dá)量分別為2.28±0.28，0.94±0.11，1.58±0.15和0.63±0.06。
　　 2.體外實(shí)驗(yàn):(1)恩度對(duì)體外培養(yǎng)的H22細(xì)胞抑制率在4～8%左右，有劑量依賴

12、性，沒有時(shí)間依賴性；欖香烯對(duì)H22細(xì)胞的抑制率在10～40%左右，且具有時(shí)間、劑量依賴性；恩度不能增強(qiáng)欖香烯對(duì)H22細(xì)胞增殖的抑制作用。(2)恩度和欖香烯均能下調(diào)H22細(xì)胞上清液中VEGF、CD44V6、MMP-2和HIF-1α的水平，兩者聯(lián)合后可增強(qiáng)該作用。(3)恩度和欖香烯可抑制H22細(xì)胞中VEGF和MMP-2蛋白的表達(dá)，兩者聯(lián)合能進(jìn)一步增強(qiáng)該作用。
　　 結(jié)論：
　　 體內(nèi)實(shí)驗(yàn)證明，8mg/kg劑量恩度聯(lián)合100m

13、g/kg劑量欖香烯可以協(xié)同抑制荷H22腹水瘤小鼠惡性腹水的產(chǎn)生，并能延長(zhǎng)荷瘤小鼠生存期。兩者聯(lián)合協(xié)同增效的可能機(jī)制是:(1)恩度增強(qiáng)了欖香烯對(duì)腹水瘤細(xì)胞的直接抑制殺傷作用；(2)兩藥聯(lián)合有效降低循環(huán)血中活的內(nèi)皮細(xì)胞占外周有核細(xì)胞的百分比；(3)兩藥聯(lián)合從蛋白水平和基因水平進(jìn)一步抑制了VEGF的表達(dá)，從而降低小鼠腹膜微血管的滲透性，并減少蛋白、紅細(xì)胞等從外周血中滲透入腹膜腔；(4)抑制腹水中CD44V6、MMP-2和HIF-1α等細(xì)胞因子