重組人Ⅱ型膠原250-270多肽的鑒定及其特異性免疫調節(jié)作用的研究.pdf

1、類風濕關節(jié)炎是一種以多關節(jié)侵蝕破壞為特征的全身性炎性自身免疫病。發(fā)病率約為0.3～1.0％，致殘率和死亡率均高。RA的病因及發(fā)病機制目前尚不完全清楚，迄今尚無根治療法。 口服耐受是指口服某種抗原物質后機體對該抗原再次接觸時表現的一種免疫無應答狀態(tài)，可以作為治療許多疾病特別是自身免疫性疾病的手段，并具有無毒、方便和抗原特異性的特點，因此，口服耐受成為免疫學和臨床研究的熱點。膠原誘導性關節(jié)炎是采用￠ò型膠原￠ò免疫膠原敏感品系的鼠類

2、，從而誘導多關節(jié)炎癥的發(fā)生。CIA動物模型的癥狀和關節(jié)病理變化與RA 相似，被廣泛用于研究人類RA發(fā)病機制和探索治療新方法。已有研究表明，口服CⅡ或CⅡ免疫顯性多肽可抑制CIA 的發(fā)展。合成CⅡ250-270 多肽內含有免疫顯性T 細胞表位CⅡ260-270，可誘導敏感品系小鼠發(fā)生CIA 和免疫耐受，對研究CIA 和RA 的發(fā)病機理和治療都具有重要意義。 化學合成多肽技術復雜、代價昂貴、產量少和難于標準化，無法滿足基礎研究和臨

3、床應用的需要，而采用基因工程技術生產的重組多肽產品則可以解決這一問題。因此，本研究對重組人CⅡ250-270 基因進行表達，獲得了重組人CⅡ250-270 多肽，對此肽段進行分離、純化和鑒定。 雖然，應用口服抗原誘導免疫耐受治療自身免疫性疾病，在許多動物模型中己取得了令人滿意的結果。但在臨床以此方法治療RA 患者時，結果卻不盡人意。為探討口服耐受在治療RA 中確切機制和效果，本研究通過給予CIA 小鼠早期口服低劑量CⅡ250-

4、270 多肽，觀察其對CIA 的特異性細胞和體液免疫反應的調節(jié)作用。同時，建立了在單細胞水平上對抗原特異性淋巴細胞的檢測體系，使用流式細胞儀同時分析溴代脫氧尿嘧啶核苷摻入、細胞內細胞因子、細胞表面活化標志并采用酶聯免疫吸附測定法檢測特異性抗體和酶聯免疫斑點測定法檢測抗原特異性抗體形成細胞的綜合檢測方法，有助于更好地理解口服耐受的免疫學機制。 目的: 獲得大量rhCⅡ250-270 多肽，鑒定并確認rhCⅡ250-270

5、 多肽與預期的相符。建立一種評估抗原特異性細胞和體液免疫反應的免疫標記和方法，有助于口服耐受在疾病治療的研究。研究CⅡ250-270 多肽在RA 和CIA 發(fā)病中作用及其機制，并為應用口服CⅡ250-270 多肽治療RA 提供理論依據。 方法: 1. rhCⅡ250-270 多肽的表達、純化和鑒定：在E.coli BL21 中表達rhCⅡ250-270 蛋白多肽，用親和層析法分離純化。用限制性酶切法、聚合酶鏈式反應（p

6、olymerase chain reaction，PCR）法、基因序列測定法、瓊脂糖凝膠電泳法、十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳法（sodiumdodecyl sulphate-polyacrylamine gel electrophoresis，SDS-PAGE）和免疫印跡法（Western Blotting）等方法在基因和蛋白水平上對rhCⅡ250-270 多肽進行鑒定。 2. rhCⅡ250-270 多肽免疫原性的研究

7、：以不同濃度（0.5、1.0、2.0mg/mL）的6 聚rh CⅡ250-270 和（20、200 、2000μg/mL）CⅡ刺激體外培養(yǎng)的RA 患者PBMC，等濃度的PBS 作為陰性對照，PHA 刺激組作為陽性對照。流式細胞儀測定刺激前后各組培養(yǎng)細胞中T 細胞表面活化標志性抗原（CD69，CD25）的表達及5-溴脫氧尿嘧啶（BrdU）在DNA 中的摻入；rhCⅡ250-270 免疫CIA 敏感小鼠DBA/1，比較與CⅡ和合成CⅡ250

8、-270免疫后在體內血清特異性抗體水平的差異。 3. 建立CIA 模型和誘導口服耐受：雞Ⅱ型膠原(chicken collagen Ⅱ，CCⅡ)在DBA/1 小鼠(H-2q 單倍型)尾部皮內注射，定期觀察并進行關節(jié)評分；在CⅡ免疫小鼠前一周，給予口服rhCⅡ250-270 多肽（0.5mg/mL）或合成多肽（0.1mg/mL），分別兩次。 4. rhCⅡ250-270 多肽對實驗動物脾臟特異性T 淋巴細胞活化及增殖實

9、驗：取加強免疫后7d 治療組和CIA 對照組的小鼠脾臟淋巴細胞，體外經CⅡ250-270、CⅡ和PHA 刺激培養(yǎng)后，采用BrdU 摻入法和流式細胞術同時測定CⅡ特異性T 細胞增殖情況、細胞膜表面標志；并通過流式細胞術測定外周血中CD4+T 細胞的細胞內細胞因子干擾素-γ(interferon-γ，IFN-γ)、白細胞介素-4 (interleukin-4，IL-4)的水平分析輔助性T 細胞1（helper T cell 1，Th1）和T

10、h2 亞群的變化。 5. rhCⅡ250-270 多肽對實驗動物脾臟特異性B 淋巴細胞反應：用ELISA 法測定加強免疫后7d 各組小鼠血清中抗CⅡ抗體的表達；用ELISPOT 法檢測加強免疫后7d 各組小鼠脾臟淋巴細胞特異性抗CⅡ抗體形成脾細胞。 6. 組織病理學檢查：加強免疫后6周，取小鼠的炎癥關節(jié)進行HE 染色。觀察關節(jié)病變的變化情況并對其進行評分。 結果: 1. 純化的rhCⅡ250-270

11、多肽，大小約43 kD，純度為89.3％。EcoRⅠ和SalⅠ雙酶切法和PCR法得到的DNA大小約為500bp和650bp，與預期的522bp和679bp基本相符，基因序列測定證實基因DNA序列與設計的完全相符。SDS-PAGE結果顯示rhCⅡ250-270多肽目的蛋白條帶的大小約為43 kD，與設計預期相符。Western Blotting結果顯示GST融合蛋白上存在CⅡ片段。 2. rhCⅡ250-270多肽能刺激RA患者

12、PBMC中的特異性淋巴細胞活化和增殖反應，同樣可以誘導CIA敏感小鼠特異性抗體的活化，血清抗體水平與CⅡ和合成CⅡ250-270免疫組無顯著性差異。提示重組CⅡ250-270具有CⅡ及合成CⅡ250-270相似的免疫學活性。 3. DBA/1小鼠口服重組CⅡ250-270或合成CⅡ250-270多肽后， CIA的發(fā)病率低于對照組（口服PBS），關節(jié)炎評分也較對照組明顯降低，關節(jié)炎發(fā)病延遲，且體重未減輕,而CIA對照組小鼠的體重

13、則有所下降。表明CⅡ250-270多肽可在一定程度上減輕CIA小鼠病情。 4. 口服CⅡ250-270多肽可誘導對小鼠脾細胞中的抗原特異性T細胞的活化增殖及IFN-γ的分泌的抑制?？诜﨏Ⅱ250-270 多肽小鼠脾細胞中CD3+CD25+ 抗原特異性T細胞的百分比（18.76％）比對照組（30.67％）明顯下降， P<0.01；口服rhCⅡ250-270多肽0.5mg組和syCⅡ250-270多肽0.1mg組CD3+BrdU+

14、 T細胞的百分比分別為27.67％和24.79％，明顯低于對照組（50.46％）， P<0.01；口服CⅡ250-270多肽組脾細胞用rhCⅡ250-270多肽再刺激后，分泌IFN-γ的陽性細胞率為9.86％和12.89％，明顯低于對照組的24.36％， P<0.01。 5. 口服CⅡ250-270小鼠血清中抗CⅡ和抗CⅡ250-270 的IgG抗體水平[A值分別為（0.82 ± 0.02）、（0.84 ± 0.04）]比CⅡ

15、免疫對照組[抗CⅡ的IgG抗體水平，A值為（1.01 ± 0.06）]顯著降低，而且特異性抗CⅡ250-270的IgG抗體反應在口服多肽組被明顯抑制（ P<0.01）。同時，口服CⅡ250-270小鼠的CⅡ和CⅡ250-270特異性抗體形成脾細胞的增殖頻率分別為（158 ± 9計數/孔）、（181 ± 10計數/孔），比CⅡ免疫對照組[CⅡ特異性抗體形成脾細胞的增殖頻率為（247 ± 16計數/孔）]也顯著減少（ P<0.05）。

16、 6. 組織病理學觀察，口服CⅡ250-270多肽，CIA小鼠關節(jié)破壞情況也得到了改善。炎細胞浸潤、滑膜增生和血管翳的形成，軟骨及骨組織損傷，口服rhCⅡ250-270多肽0.5mg組和syCⅡ250-270多肽0.1mg組，比口服PBS對照組，組織病理學評分均有所降低。 結論: 本研究對rhCⅡ250-270多肽進行了較全面的鑒定，發(fā)現此肽段具有較強的免疫原性，可刺激RA患者PBMC中的特異性淋巴細胞活化和增殖反