TGF-β1siRNA對膀胱腫瘤血管生成的影響.pdf

1、膀胱腫瘤是臨床上最常見的一種泌尿系統(tǒng)腫瘤，而且也是一種威脅患者生命的疾病。膀胱癌的生物學行為特別復雜，主要變現(xiàn)為:復發(fā)、多發(fā)、浸潤和轉(zhuǎn)移等。90％的膀胱癌是尿路上皮癌，且具有高復發(fā)性率。膀胱癌的發(fā)生、發(fā)展及復發(fā)機制目前尚不明了，近年來隨著相關研究的深入，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)化生長因子β1(Transforming growth factorsβ1，TGF-β1)能促進腫瘤血管的生成從而導致癌細胞的擴散轉(zhuǎn)移。
　　目的:探討通過選擇人工設計合成抑

2、制作用最佳的TGF-β1siRNA轉(zhuǎn)染入人膀胱癌細胞株進行培養(yǎng)，來明確TGF-β1siRNA對膀胱腫瘤血管生成的影響。
　　方法:將膀胱癌細胞株進行培養(yǎng)，取對數(shù)生長期的膀胱癌細胞分為常規(guī)細胞組、脂質(zhì)體組（陰性對照組）和3組（A組、B組和C組）含不同TGF-β1siRNA表達載體組。選擇人工設計合成好的三種TGF-β1siRNA，通過質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染入A組、B組和C組后，轉(zhuǎn)染細胞培養(yǎng)24小時后使用實時熒光定量聚合酶鏈式反應(real-t

3、ime PCR)與雙抗體一步夾心法酶聯(lián)免疫吸附試驗(Elisa)共同檢測轉(zhuǎn)染TGF-β1siRNA的人膀胱癌細胞株TGF-β1的表達，選出最佳抑制組。取對數(shù)生長期的膀胱癌細胞進行轉(zhuǎn)染，將膀胱癌細胞分為EJ腫瘤細胞組、對照組（TGF-β1組）、重組質(zhì)粒組（TGF-β1siRNA表達載體組）。對照組采用10ng/ml TGF-β1刺激，轉(zhuǎn)染細胞培養(yǎng)24小時后應用蛋白印跡法(Western Blot)檢測該組與正常EJ細胞組、TGF-β1組、

4、重組質(zhì)粒組中血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)蛋白表達水平。
　　結(jié)果:人膀胱癌細胞株培養(yǎng)良好，TGF-β1siRNA轉(zhuǎn)染成功。RT-PCR檢測發(fā)現(xiàn):與常規(guī)培養(yǎng)的EJ細胞組比較，TGF-β1mRNA在轉(zhuǎn)染空白質(zhì)粒的EJ細胞組內(nèi)的表達無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)，表明轉(zhuǎn)染的空白質(zhì)粒對TGF-β1mRNA的表達無明顯干擾;與常規(guī)細胞組和空白質(zhì)粒組比較，TGF-β1mRNA在三個不同TGF-β1SiRNA組 EJ細胞內(nèi)的表達均有顯著下降(P＜

5、0.05)，其中C組最顯著(P＜0.01)，表明所設計的三種TGF-β1SiRNA對TGF-β1mRNA的表達均具有抑制作用，其中C組TGF-β1SiRNA序列與其他序列比較具有最佳抑制效果。Elisa檢測發(fā)現(xiàn):與常規(guī)培養(yǎng)的EJ細胞組比較，TGF-β1蛋白在轉(zhuǎn)染空白質(zhì)粒的EJ細胞內(nèi)的表達無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)，表明轉(zhuǎn)染的空白質(zhì)粒對TGF-β1蛋白的表達無明顯干擾，與RT-PCR檢測的結(jié)果一致;與常規(guī)細胞組和空白質(zhì)粒組比較，TGF-

6、β1蛋白在三個不同TGF-β1SiRNA組EJ細胞內(nèi)表達均有顯著下降(P＜0.05)，與RT-PCR檢測結(jié)果一致，TGF-β1蛋白的Elisa檢測也印證了所設計的三種TGF-β1SiRNA對TGF-β1的表達均具有抑制作用。使用Western Blot檢測各組VEGF蛋白的表達:與正常EJ細胞組比較，VEGF蛋白在轉(zhuǎn)染TGF-β1質(zhì)粒的EJ細胞中的表達量顯著增大(P＜0.05)，表明VEGF蛋白的表達與TGF-β1呈正相關;與正常EJ細