NLRC4炎癥小體激活的分子機制研究.pdf

1、哺乳動物的巨噬細胞、樹突狀細胞是宿主先天性免疫反應的重要組成部分。在細菌感染發(fā)生時，這些細胞通過分泌各種細胞因子以及發(fā)生一種以Caspasel激活為特征的被稱為“pyroptosis”的細胞死亡來抑制細菌的繁殖散布，幫助細菌的清除。目前已知這些細胞通過識別細菌來源的一些保守分子而被激活，這些保守分子包括細菌的鞭毛蛋白和三型分泌系統(tǒng)的基座蛋白。通過遺傳學的方法構建基因敲除的小鼠，人們發(fā)現(xiàn)宿主細胞中的Nlrc4基因在這一信號轉導通路中發(fā)揮著

2、重要作用。NLRC4屬于近年來新發(fā)現(xiàn)的Nod-LikeReceptors(NLRs)家族，結構域預測顯示該蛋白具有N端CARD結構域、中間結合核酸的結構域以及C端富含亮氨酸的結構域LRRs(LeucineRichRepeats)。LRRs存在于表達在細胞表面的Toll-LikeReceptor(TLRs)中，這一結構域可以直接結合配體包括來源于細菌的內毒素、核酸以及鞭毛蛋白并且激活下游NF-κB信號傳導通路。這一結構域的存在使得人們猜測

3、NLRC4蛋白也是通過作為基座蛋白、鞭毛蛋白的受體發(fā)揮作用的，但是目前還沒有證據支持這一假設。我們試圖研究NLRC4分子參與宿主細胞識別鞭毛蛋白以及基座蛋白的機制。利用炭疽病原菌分泌的致死毒素進入細胞質的機制，我們建立了把鞭毛蛋白等刺激物轉運進入細胞質的新方法以代替細菌感染的體系。這樣的體系更利于生化機制的研究，利用在巨噬細胞基因敲低的方法，我們發(fā)現(xiàn)了Naip2、Naip5基因的敲低可以分別抑制三型分泌系統(tǒng)基座蛋白和鞭毛蛋白激活巨噬細胞

4、Caspasel，表明這兩個基因分別參與了基座蛋白和鞭毛蛋白引起的NLRC4信號通路的激活。通過酵母雙雜交和免疫共沉淀的實驗方法，我們發(fā)現(xiàn)NAIP2、NAIP5蛋白可以特異性的結合基座蛋白和鞭毛蛋白。NAIP2、NAIP5結合相應的配體后會招募NLRC4形成蛋白復合物并且激活Caspasel，激活形式的Caspasel切割前體形式的IL-1β、IL-18為成熟形式并促進這些細胞因子的分泌。這一信號通路可以在外源轉染NAIP、NLRC4、

5、Caspasel、pro-IL-1β四個蛋白表達基因的非免疫細胞得到功能性的重組，有力的證明了NAIP蛋白的功能。我們的研究結果揭示了宿主細胞識別細菌來源異源物質的機制，首次證明了NLRs家族中的NAIP2、NAIP5蛋白分別作為基座蛋白和鞭毛蛋白的直接受體行駛功能，而NLRC4蛋白只是起到傳遞信號至下游分子的作用。
　　 Naip基因在小鼠中有7個直系同源基因，在人類卻只有一個對應的基因。我們的研究揭示了小鼠中其中兩個成員的功

6、能是作為胞內受體識別細菌來源的異源保守分子，這也提示了其它NAIP蛋白成員可能識別目前尚未發(fā)現(xiàn)的細菌來源刺激物。通過細菌遺傳學的研究，我們發(fā)現(xiàn)組成病原菌三型分泌系統(tǒng)的結構蛋白中除了基座蛋白，組成其針狀孔道的單體蛋白Neddleprotein也能在鼠源巨噬細胞上激活Caspasel，并且這種激活依賴于Nlrc4基因的表達。同樣通過小RNA介導的基因敲低方法，我們發(fā)現(xiàn)了NAIP1蛋白在Neddleprotein識別中發(fā)揮作用。