LncRNA Gm4419通過NF-kappaB-NLRP3炎癥小體信號通路調(diào)控糖尿病腎病炎癥的分子機制研究.pdf

1、糖尿病腎病(diabetic nephropathy,DN)作為終末期腎病的主要原因，是糖尿病的常見并發(fā)癥之一。近年來，研究證據(jù)表明核轉(zhuǎn)錄因子Kappa B(nuclear factor kappa B,NF-κB)的激活和含有熱蛋白結(jié)構(gòu)域的甘氨酸結(jié)合及寡聚結(jié)構(gòu)域樣受體3炎癥因子(NACHT,LRR and PYD domain-containing protein3,NLRP3炎癥小體)在糖尿病腎病的炎癥進展過程密切相關(guān)。然而，它們的

2、機體作用機制尚不清楚。近年來研究顯示，長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA,lncRNA)異常表達在糖尿病腎病等多種疾病中扮演著重要角色。然而，lncRNA在糖尿病腎病的炎癥過程中的功能和作用機制仍未揭開神秘面紗。
　　在我們課題組前期實驗中，我們通過轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)(RNA sequencing,RNA-seq)和實時熒光定量 PCR(real-time fluorescent quantitative PCR

3、,qRT-PCR)在糖尿病腎病db/db小鼠腎臟組織中鑒別了14個呈異常表達的lncRNAs。在目前的實驗中，我們進一步通過qRT-PCR檢測這14個糖尿病腎病相關(guān)的 lncRNAs在高、低糖條件下培養(yǎng)的系膜細胞中的表達情況，實驗結(jié)果顯示其中12個lncRNA在腎臟組織和系膜細胞中的表達趨勢一致。我們通過生物信息學(xué)預(yù)測進一步發(fā)現(xiàn)在這12個異常表達的lncRNAs中，只有上調(diào)差異倍數(shù)最大的基因間長鏈非編碼RNA Gm4419與糖尿病腎病炎

4、癥相關(guān)的NF-κB亞基p65和p50存在潛在的結(jié)合位點點。此外，沉默Gm4419能夠明顯抑制高糖條件下培養(yǎng)的系膜細胞促炎癥因子、腎臟纖維標記蛋白的表達和細胞增殖。然而過表達Gm4419能夠促進低糖條件下培養(yǎng)的系膜細胞的系膜細胞的促炎癥因子、腎臟纖維標記蛋白的表達和細胞增殖。更有趣的是，Gm4419通過直接與NF-κB的亞基p50相互作用激活NF-κB通路。另外，我們發(fā)現(xiàn)在系膜細胞中p50能直接作用于NLRP3炎癥小體。因此，我們用以下實

5、驗展示，lincRNA Gm4419可能通過NF-κB/NLRP3炎癥小體信號通路參與高糖條件下培養(yǎng)的系膜細胞炎癥、纖維化和增殖，這可能為Gm4419在糖尿病腎病的進展過程中的調(diào)控機制提供新視角。
　　第一部分 Gm4419在小鼠腎小球系膜細胞中的表達、分布及對系膜細胞炎癥、纖維化和增殖的影響
　　目的：
　　檢測高、低糖培養(yǎng)的小鼠腎小球系膜細胞中G m4419的表達、分布以及G m4419對高、低糖培養(yǎng)的系膜細胞炎癥

6、、纖維化和增殖的影響，初步探討Gm4419與糖尿病腎病的關(guān)系。
　　方法：
　　通過qRT-PCR檢測14個糖尿病腎病相關(guān)的lncRNAs在高、低糖條件下培養(yǎng)的系膜細胞中的表達情況，并從中選取上調(diào)差異倍數(shù)最大，且生物信息學(xué)預(yù)測唯一與糖尿病腎病炎癥相關(guān)的NF-κB有綁定位點的lncRNA Gm4419為研究對象。FISH和qRT-PCR檢測Gm4419在系膜細胞中的定位；構(gòu)建 pcDNA3.1(+)-Gm4419過表達質(zhì)粒，同

7、時設(shè)計合成 Gm4419 siRNA，并將pcDNA3.1(+)-Gm4419過表達質(zhì)粒和Gm4419 siRNA分別轉(zhuǎn)染至低、高糖培養(yǎng)的腎小球系膜細胞，qRT-PCR檢測促炎癥因子和腎臟纖維標記蛋白的mRNA表達水平；western blot和免疫熒光檢測促炎癥因子和腎臟纖維標記蛋白的蛋白表達水平情況；EdU法和流式細胞術(shù)檢測轉(zhuǎn)染后細胞的增殖能力。
　　結(jié)果：
　　Gm4419在高糖培養(yǎng)的腎小球系膜細胞中的表達水平較L-M

8、C組顯著增高(P＜0.01)。將酶切和測序結(jié)果證實構(gòu)建成功的pcDNA3.1(+)-Gm4419過表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至L-MC組細胞，與L-MC mock組或L-MC pcDNA3.1組相比，L-MC Gm4419(+)組細胞炎癥因子、纖維化標記蛋白表達水平增高以及增殖能力增強((P＜0.05)。此外，qRT-PCR篩選出一條最佳干擾Gm4419的小干擾RNA(small interfering RNA,siRNA)，轉(zhuǎn)染H-MC組后，與H-

9、MC mock組或H-MC siNC比較，H-MC Gm4419 siRNA組細胞炎癥因子、纖維化標記蛋白表達水平增高以及增殖能力減少(P＜0.05)。
　　結(jié)論：
　　lncRNA-Gm4419參與糖尿病腎病小鼠腎小球系膜炎癥、增生和纖維化的調(diào)節(jié)。
　　第二部分 Gm4419通過NF-κB/NLRP3炎癥小體信號通路調(diào)控腎小球系膜細胞中促炎癥因子的表達
　　目的：
　　探討調(diào)節(jié)Gm4419的表達對NF-κ

10、B/NLRP3炎癥小體信號途徑激活的調(diào)控及對下游促炎癥因子、纖維標記蛋白和系膜細胞增殖的影響。
　　方法：
　　通過qRT-PCR檢測小鼠腎小球系膜細胞在低糖條件下轉(zhuǎn)染Gm4419過表達質(zhì)粒對NF-κB亞基p50和p65的mRNA相對表達水平的影響；通過 qRT-PCR檢測小鼠腎小球系膜細胞在高糖條件下轉(zhuǎn)染Gm4419 siRNA對NF-κB亞基p50和p65的mRNA相對表達水平的影響；通過western blot檢測小鼠

11、系膜細胞在低糖條件下轉(zhuǎn)染Gm4419過表達質(zhì)粒對NF-κB轉(zhuǎn)錄因子關(guān)鍵蛋白p-IκBα、IκBα、p50和p65相對表達水平的影響；通過western blot檢測小鼠系膜細胞在高糖條件下轉(zhuǎn)染Gm4419 siRNA對NF-κB轉(zhuǎn)錄因子關(guān)鍵蛋白p-IκB、IκB、p50和p65相對表達水平的影響；細胞免疫熒光化學(xué)定位小鼠系膜細胞中轉(zhuǎn)染Gm4419過表達質(zhì)粒和Gm4419 siRNA對p50和p65進入細胞核情況的影響；通過ChIP檢測調(diào)

12、節(jié)Gm4419的表達對NF-κB轉(zhuǎn)錄因子與Gm4419和NLRP3炎癥小體啟動子結(jié)合以及轉(zhuǎn)錄的影響；通過qRT-PCR和FISH檢測調(diào)節(jié)p50的表達對細胞核和細胞質(zhì)中Gm4419表達的影響；通過qRT-PCR、western blot、細胞免疫熒光化學(xué)和FISH檢測同時過表達或同時沉默Gm4419和p50對Gm4419和p50的mRNA水平以及p50的蛋白水平的影響；通過qRT-PCR檢測過表達Gm4419或p50對NLRP3炎癥小體m

13、RNA表達的影響；通過qRT-PCR檢測沉默Gm4419或p50對NLRP3炎癥小體 mRNA表達的影響；通過western blot和細胞免疫熒光化學(xué)檢測調(diào)節(jié)Gm4419或p50的表達對NLRP3炎癥小體蛋白表達的影響；通過免疫沉淀檢測 p50抗體能否沉淀內(nèi)源性NLRP3炎癥小體蛋白；通過細胞免疫熒光化學(xué)檢測 p50與內(nèi)源性NLRP3炎癥小體之間的共定位情況；通過western blot檢測SN50特異性阻斷p50或(和)JSH-23

14、特異性阻斷p65的活性后，調(diào)節(jié)Gm4419的表達對 NLRP3炎癥小體及下游炎癥因子的蛋白表達的影響；通過western blot檢測在過表達Gm4419，并同時阻斷p65的活性后Gm4419對NLRP3炎癥小體及下游炎癥因子的蛋白表達的影響。
　　結(jié)果：
　　QRT-PCR結(jié)果顯示，過表達Gm4419可以促進p50和p65 mRNA表達(P＜0.01)，而沉默Gm4419可以抑制p50和p65 mRNA表達(P＜0.01)

15、；western blot結(jié)果顯示，過表達Gm4419可以促進IκB磷酸化形成p-IκB并降解從而引起細胞核內(nèi)p50和p65相對表達水平明顯升高(P＜0.01)，而沉默Gm4419可以抑制IκB磷酸化形成p-IκB并降解從而引起細胞核內(nèi)p50和p65相對表達水平明顯降低(P＜0.01)；細胞免疫熒光化學(xué)顯示，過表達Gm4419可以促進p50和p65蛋白向細胞內(nèi)轉(zhuǎn)移，而沉默Gm4419可以抑制p50和p65蛋白向細胞內(nèi)轉(zhuǎn)移；ChIP檢測結(jié)

16、果發(fā)現(xiàn)過表達Gm4419可以促進 p50而非p65蛋白與Gm4419和NLRP3炎癥小體啟動子結(jié)合并促進它們轉(zhuǎn)錄(P＜0.01)，而沉默Gm4419可以抑制p50而非p65蛋白與Gm4419和NLRP3炎癥小體啟動子結(jié)合并抑制它們轉(zhuǎn)錄(P＜0.01)；qRT-PCR和FISH結(jié)果顯示，過表達p50可以促進細胞核和細胞質(zhì)內(nèi)Gm4419表達，而沉默p50可以抑制細胞核和細胞質(zhì)內(nèi)Gm4419表達；qRT-PCR、western blot細胞免

17、疫熒光化學(xué)和 FISH結(jié)果顯示，同時過表達 Gm4419和 p50可以促進Gm4419和p50的mRNA水平以及p50的蛋白水平顯著升高，而沉默Gm4419和p50可以抑制Gm4419和p50的mRNA水平以及p50的蛋白水平顯著降低；qRT-PCR結(jié)果顯示，過表達Gm4419或p50可以促進NLRP3炎癥小體 mRNA表達，而沉默 Gm4419或 p50可以抑制NLRP3炎癥小體mRNA表達；western blot和細胞免疫熒光化學(xué)

18、結(jié)果顯示，過表達Gm4419或p50可以促進NLRP3炎癥小體蛋白表達，而沉默Gm4419或p50可以抑制NLRP3炎癥小體蛋白表達；免疫沉淀結(jié)果顯示，p50抗體能夠沉淀內(nèi)源性NLRP3炎癥小體；細胞免疫熒光化學(xué)顯示p50與內(nèi)源性NLRP3炎癥小體在系膜細胞中存在共定位現(xiàn)象；western blot結(jié)果顯示，在低糖培養(yǎng)的系膜細胞中過表達Gm4419，加入p50的特異性活性阻斷劑SN50或同時加入SN50和p65的特異性活性阻斷劑JSH-