利用泛素相關siRNA文庫篩選NF-κB信號通路調控分子以及對NLRP3炎癥小體調控機制的初步探索.pdf

1、核轉錄因子NF-κB是一個非常重要的調節(jié)蛋白，在免疫應答、炎癥反應和腫瘤發(fā)生發(fā)展中都發(fā)揮不可替代的作用。然而，很多炎癥相關的疾病以及惡性腫瘤的發(fā)生都與NF-κB的過度激活密切相關。所以，機體在一定程度上都會保持NF-κB信號通路的穩(wěn)態(tài)。在深入研究NF-κB信號通路過程中，我們發(fā)現(xiàn)NF-κB信號通路中的很多關鍵分子都會出現(xiàn)多種翻譯后修飾的情況，其中又以泛素化修飾為主。在經(jīng)典NF-κB信號通路激活過程中，RIP1、TRAF2、NEMO等重要

2、的接頭蛋白或激酶都會發(fā)生泛素化修飾，并且NF-κB的激活依賴于這些蛋白的泛素化修飾。
　　我們的研究目的是發(fā)現(xiàn)調節(jié)NF-κB信號通路的重要分子。然而，目前的研究手段基本上是基于蛋白質相互結合。綜合上文，我們以泛素化修飾為切入點，試圖去探索尋找結合這些泛素化修飾的重要通路分子的蛋白，從而發(fā)現(xiàn)新的NF-κB調控分子。因此，我們通過生物信息學分析找到具有親和泛素化鏈的結構域的蛋白，它們可能作用在泛素化修飾從而進一步調控NF-κB的激活。

3、我們通過結構域分析出203個包含一種或多種泛素結合結構域和多個泛素相關結構域的蛋白，并構建siRNA文庫。利用這個siRNA文庫我們篩選出了20多個可能的NF-κB調控分子，我們對其中RNF4和UBXN1兩個基因進行了較為深入的研究。
　　通過雙熒光素酶報告基因實驗我們發(fā)現(xiàn)，敲低RNF4能夠明顯促進經(jīng)典NF-κB信號通路的激活，同時過表達RNF4能明顯抑制經(jīng)典NF-κB信號通路的激活。進一步，我們發(fā)現(xiàn)RNF4能夠抑制TRADD、T

4、RAF2、Myd88、IRAK1和TAK1而非IKKβ介導的NF-κB的激活，同時RNF4能抑制經(jīng)典NF-κB通路激活過程中的IKKβ磷酸化和IκBα磷酸化降解進程。說明，RNF4的調控作用可能作用在TAK1水平以上。接下來，我們通過質譜鑒定到TAK1可能是RNF4的一個相互作用蛋白，并且通過免疫沉淀實驗證明RNF4與TAK1-TAB2-TAB3復合體相互作用。此外，我們發(fā)現(xiàn)RNF4能介導TAB2的溶酶體途徑降解，并且這個過程依賴于其泛

5、素連接酶活性。綜上，我們發(fā)現(xiàn)了一個負調控經(jīng)典NF-κB信號通路的蛋白RNF4，可能作為維持NF-κB穩(wěn)態(tài)的一個重要靶點。
　　對于UBXN1調控機制的研究，我們使用類似的技術手段，發(fā)現(xiàn)UBXN1也是一個負調控NF-κB信號通路的調控子。敲低UBXN1促進經(jīng)典NF-κB的激活，同時增強下游靶基因的轉錄以及炎性因子的分泌。過表達UBXN1能劑量依賴的抑制NF-κB的激活。更重要的是，UBXN1與TNFα受體復合體組分cIAPs相互作用

6、，并且敲低UBXN1能顯著增強TNFR1對cIAP1的招募，說明UBXN1是一個作用在TNFα受體復合體水平的調控分子。
　　另一部分工作是關于NLRP3炎癥小體調控機制的探索。NLRP3炎癥小體屬于機體固有免疫的范疇，在機體免疫反應和疾病發(fā)生過程中具有非常重要的作用。NLRP3炎癥小體能被多種病原相關分子模式(PAMPs)和損傷相關分子模式(DAMPs)所激活。NLRP3炎癥小體在許多疾病的發(fā)生過程中都發(fā)揮重要作用，包括自身炎癥

7、反應、Ⅱ型糖尿病和阿茲海默病等。因此，研究NLRP3炎癥小體的激活和調控機制可能為將來的炎癥誘導相關疾病的治療提供新的靶標。
　　通過酵母雙雜交，我們發(fā)現(xiàn)一系列可能的NLRP3相互作用蛋白。我們初步探索了其中兩個蛋白PEX5和FTH1對NLRP3炎癥小體激活的影響。我們發(fā)現(xiàn)PEX5敲低能夠抑制NLRP3炎癥小體介導的成熟性白介素1β的分泌。同樣，F(xiàn)TH1敲低后能明顯阻礙NLRP3炎癥小體的活性，并且還能抑制ASC寡聚化。以上結果初