miR-451通過LMP7-NF-kappaB信號通路調控小鼠糖尿病腎病的機制研究.pdf

1、糖尿病腎?。╠iabetic nephropathy, DN）是引起糖尿病患者終末期腎病和過早死亡的主要原因，近年來，研究者們發(fā)現(xiàn)炎癥通路在糖尿病腎病的發(fā)展發(fā)揮核心作用。在糖尿病腎病的動物實驗和臨床研究中，各種促炎癥分子,包括腫瘤壞死因子-α（Tumor necrosis factor alpha， TNF-α）、白介素-18（ Interleukin-18,IL-18）、細胞間黏附分子-1（Intercellular cell adh

2、esion molecule-1，ICAM-1）以及髓樣分化因子88（Myeloid differentiation factor88，MYD88）均被發(fā)現(xiàn)異常增高。而這些促炎癥分子的轉錄受到了核因子- kappa B的調節(jié)(Nuclear factor-kappa B，NF-κB)，并促進了糖尿病腎損害的進展，包括細胞外基質的改變、纖維化、腎小球硬化癥等。
　　經(jīng)過近十年來的研究，越來越多的證據(jù)表明microRNA（miRNA）

3、在參與了糖尿病腎病的發(fā)生發(fā)展。在我們之前的研究中，我們發(fā)現(xiàn)上調 miR-451抑制早期糖尿病腎病系膜增殖。而最近的研究證據(jù)表明， miR-451特異表達于人類疾病，并對炎癥反應具有關鍵作用。然而，在糖尿病腎病中miR-451和NF-κB激活的相互關系尚不清楚。
　　當NF-κB抑制蛋白α（IκBα）被免疫蛋白酶體降解時，可以釋放活化的NF-κB轉錄因子，并從細胞質中轉入到細胞核內。大型多功能蛋白酶7(Large multifunc

4、tional protease7，LMP7)是免疫蛋白酶體的催化核心之一。有研究發(fā)現(xiàn)， LMP7促進NF-κB轉錄因子的活化從而促進炎癥反應。因此，我們推測，LMP7的高表達可能通過影響 NF-κB轉錄因子的活性從而影響糖尿病腎病的發(fā)生發(fā)展。
　　在我們早期的肺癌研究中發(fā)現(xiàn)， LMP7是miR-451的靶基因。我們推測在糖尿病腎病中是否miR-451可以靶向調控LMP7，但是這個問題還沒有被研究證實。因此，我們用以下的實驗展示，在

5、糖尿病腎病中，miR-451通過靶向調控LMP7抑制NF-κB介導的促炎癥分子表達，從而緩解糖尿病腎病對腎小球的傷害。
　　第一部分 miR-451在糖尿病腎病中的表達及靶基因驗證
　　目的：檢測高糖培養(yǎng)的小鼠腎小球系膜細胞及db/db小鼠腎皮質中miR-451的表達，初步探討 miR-451與糖尿病腎病的關系；預測并驗證miR-451對小鼠腎小球系膜細胞中LMP7的靶向調節(jié)作用。
　　方法：通過實時熒光定量 PCR檢

6、測中 miR-451相對表達水平；用生物信息學方法，預測并篩選 miR-451的靶基因 LMP7，并通過實時熒光定量 PCR和western blot檢測糖尿病腎病db/db小鼠腎皮質中以及高糖和低糖條件下培養(yǎng)的小鼠腎小球系膜細胞LMP7內源性表達變化；用實時熒光定量 PCR檢測轉染 miR-451 mimics和 inhibitor后miR-451和LMP7 mRNA的相對表達水平；western blot檢測LMP7蛋白的相對表達水

7、平；構建靶基因結合位點的野生型和突變型 LMP7表達質粒，將這些質粒和miR-451 mimics或者mimics NC共轉染293T細胞，用雙熒光素酶報告基因驗證miR-451和LMP73’ UTR靶向關系。
　　結果： miR-451在糖尿病腎病小鼠腎臟和高糖培養(yǎng)的小鼠系膜細胞中相對表達水平明顯下降（p<0.05）；LMP7在糖尿病腎病小鼠和高糖培養(yǎng)的小鼠系膜細胞中相對表達水平明顯增高（p<0.05）；轉染miR-451 mi

8、mics和 inhibitor可以有效的上調和抑制 miR-451相對表達水平（p<0.05）；經(jīng)過預測、qRT-PCR、western blot和雙熒光素酶報告基因實驗顯示 miR-451可以與靶基因 LMP73’UTR靶向結合，并且miR-451顯著調節(jié)LMP7的mRNA和蛋白相對表達水平（p<0.05）。
　　結論： miR-451相對表達水平的異常下降和小鼠糖尿病腎病密切相關；miR-451通過與靶基因LMP73’ UTR

9、結合調節(jié)LMP7的表達。
　　第二部分 miR-451通過調節(jié)LMP7/NF-κB信號通路影響小鼠系膜細胞促炎癥因子的表達
　　目的：探討調節(jié)miR-451的表達對LMP7/NF-κB信號途徑激活的調控及NF-κB轉錄因子下游的促炎癥因子轉錄影響；了解miR-451對腎纖維化的影響。
　　方法：通過 western blot檢測小鼠系膜細胞在高糖條件下轉染miR-451 mimics對NF-κB轉錄因子關鍵蛋白p-Iκ

10、B、IκB和p65相對表達水平的影響；通過western blot檢測小鼠系膜細胞在低糖條件下轉染miR-451 inhibitor對NF-κB轉錄因子關鍵蛋白p-IκB、IκB和p65相對表達水平的影響；細胞免疫熒光化學定位小鼠系膜細胞中轉染miR-451 mimics和 inhibitor對 p65進入細胞核情況的影響；western blot檢測PR-957抑制LMP7的活性后調節(jié)miR-451的表達對NF-κB轉錄因子關鍵蛋白相

11、對表達水平的影響；通過實時熒光定量 PCR和ChIP檢測調節(jié)miR-451的表達對NF-κB轉錄因子與下游的促炎癥因子基因TNF-α、IL-18、MYD88和 ICAM-1啟動子的結合以及轉錄的影響；通過實時熒光定量 PCR檢測調節(jié) miR-451的表達對促纖維化因子 TGF-β1、FN、collagen I和collagen IV轉錄mRNA的影響。
　　結果： western blot結果顯示，miR-451 mimics可以

12、抑制IκB磷酸化形成 p-IκB降解從而導致細胞核內 p65相對表達水平明顯降低（p<0.05），而miR-451 inhibitor可以促進IκB磷酸化形成p-IκB降解從而引起細胞核內p65相對表達水平明顯升高（p<0.05）；細胞免疫熒光化學顯示，miR-451 mimics可以抑制 p65蛋白向細胞內內轉移而miR-451 inhibitor可以促進 p65蛋白向細胞內內轉移；實時熒光定量PCR和 ChIP檢測結果發(fā)現(xiàn) miR-

13、451 mimics可以抑制 p65蛋白與TNF-α、IL-18、MYD88和 ICAM-1啟動子的結合并抑制它們的轉錄（p<0.05），而miR-451 inhibitor可以促進p65蛋白與TNF-α、IL-18、MYD88和 ICAM-1啟動子的結合并促進它們的轉錄（ p<0.05）；miR-451 mimics和inhibitor可以抑制或者促進纖維化因子TGF-β1、FN、collagen I和collagen IV的轉錄（p

14、<0.05）。
　　結論： miR-451通過抑制靶基因LMP7從而抑制NF-κB轉錄因子的活性，導致NF-κB轉錄因子與下游的促炎癥因子TNF-α、IL-18、MYD88和 ICAM-1基因啟動子的結合能力降低，從而引起促炎癥因子轉錄降低；同時 miR-451也抑制了促纖維化因子 TGF-β1、FN、collagen I和collagen IV轉錄。
　　第三部分 miR-451調控糖尿病腎病小鼠LMP7/NF-κB信號通

15、路的研究
　　目的：上調miR451在db/db糖尿病腎病小鼠體內對LMP7/NF-κB信號途徑和促炎癥因子轉錄的影響，并且觀察上調miR451對db/db小鼠尿微量白蛋白、血糖、腎小球肥大，系膜擴增以及腎纖維化的影響，為探索 miR-451調控糖尿病腎病分子機制提供理論基礎。
　　方法：通過尾靜脈注射 miR-451 agomir到已經(jīng)發(fā)生糖尿病腎病的db/db小鼠體內，監(jiān)測血糖和尿微量白蛋白的變化，直到經(jīng)過miR-451

16、治療的db/db小鼠血糖和尿微量白蛋白顯著低于未治療的db/db小鼠；通過實時熒光定量 PCR檢測miR-451在各組db/db小鼠腎臟中的相對表達水平；通過實時熒光定量 PCR和western blot檢測LMP7在各組db/db小鼠腎臟中的相對表達水平；western blot檢測各組db/db小鼠腎臟中NF-κB轉錄因子關鍵蛋白p-IκB、IκB和p65相對表達水平；通過實時熒光定量 PCR檢測促炎癥因子TNF-α、IL-18、M

17、YD88和 ICAM-1相對表達水平；各組腎組織經(jīng)過H&E染色后觀察并統(tǒng)計腎小球肥大和系膜擴增的情況；各組腎組織經(jīng)過Masson染色后觀察腎纖維化的情況，并通過實時熒光定量 PCR檢測促纖維化因子TGF-β1、FN、collagen I和collagen IV的相對表達水平。
　　結果：在miR-451 agomir治療的糖尿病腎病db/db小鼠中miR-451的相對表達水平明顯高于沒有注射miR-451的db/db小鼠（p<0.

18、05）；經(jīng)過miR-451 agomir治療后，LMP7的相對表達水平和NF-κB轉錄因子的活性明顯受到了抑制（p<0.05）；經(jīng)過miR-451 agomir治療后，促炎癥因子 TNF-α、IL-18、MYD88和 ICAM-1相對表達水平在糖尿病腎病db/db小鼠腎臟組織中明顯下降（p<0.05）；上調miR-451可以降低血糖和尿微量白蛋白，改善腎小球肥大、系膜擴增以及腎纖維化，抑制促纖維化因子TGF-β1、FN、collagen