miR-451通過LMP7-NF-kappaB信號(hào)通路調(diào)控小鼠糖尿病腎病的機(jī)制研究.pdf

1、糖尿病腎?。╠iabetic nephropathy, DN）是引起糖尿病患者終末期腎病和過早死亡的主要原因，近年來，研究者們發(fā)現(xiàn)炎癥通路在糖尿病腎病的發(fā)展發(fā)揮核心作用。在糖尿病腎病的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和臨床研究中，各種促炎癥分子,包括腫瘤壞死因子-α（Tumor necrosis factor alpha， TNF-α）、白介素-18（ Interleukin-18,IL-18）、細(xì)胞間黏附分子-1（Intercellular cell adh

2、esion molecule-1，ICAM-1）以及髓樣分化因子88（Myeloid differentiation factor88，MYD88）均被發(fā)現(xiàn)異常增高。而這些促炎癥分子的轉(zhuǎn)錄受到了核因子- kappa B的調(diào)節(jié)(Nuclear factor-kappa B，NF-κB)，并促進(jìn)了糖尿病腎損害的進(jìn)展，包括細(xì)胞外基質(zhì)的改變、纖維化、腎小球硬化癥等。
　　經(jīng)過近十年來的研究，越來越多的證據(jù)表明microRNA（miRNA）

3、在參與了糖尿病腎病的發(fā)生發(fā)展。在我們之前的研究中，我們發(fā)現(xiàn)上調(diào) miR-451抑制早期糖尿病腎病系膜增殖。而最近的研究證據(jù)表明， miR-451特異表達(dá)于人類疾病，并對(duì)炎癥反應(yīng)具有關(guān)鍵作用。然而，在糖尿病腎病中miR-451和NF-κB激活的相互關(guān)系尚不清楚。
　　當(dāng)NF-κB抑制蛋白α（IκBα）被免疫蛋白酶體降解時(shí)，可以釋放活化的NF-κB轉(zhuǎn)錄因子，并從細(xì)胞質(zhì)中轉(zhuǎn)入到細(xì)胞核內(nèi)。大型多功能蛋白酶7(Large multifunc

4、tional protease7，LMP7)是免疫蛋白酶體的催化核心之一。有研究發(fā)現(xiàn)， LMP7促進(jìn)NF-κB轉(zhuǎn)錄因子的活化從而促進(jìn)炎癥反應(yīng)。因此，我們推測(cè)，LMP7的高表達(dá)可能通過影響 NF-κB轉(zhuǎn)錄因子的活性從而影響糖尿病腎病的發(fā)生發(fā)展。
　　在我們?cè)缙诘姆伟┭芯恐邪l(fā)現(xiàn)， LMP7是miR-451的靶基因。我們推測(cè)在糖尿病腎病中是否miR-451可以靶向調(diào)控LMP7，但是這個(gè)問題還沒有被研究證實(shí)。因此，我們用以下的實(shí)驗(yàn)展示，在

5、糖尿病腎病中，miR-451通過靶向調(diào)控LMP7抑制NF-κB介導(dǎo)的促炎癥分子表達(dá)，從而緩解糖尿病腎病對(duì)腎小球的傷害。
　　第一部分 miR-451在糖尿病腎病中的表達(dá)及靶基因驗(yàn)證
　　目的：檢測(cè)高糖培養(yǎng)的小鼠腎小球系膜細(xì)胞及db/db小鼠腎皮質(zhì)中miR-451的表達(dá)，初步探討 miR-451與糖尿病腎病的關(guān)系；預(yù)測(cè)并驗(yàn)證miR-451對(duì)小鼠腎小球系膜細(xì)胞中LMP7的靶向調(diào)節(jié)作用。
　　方法：通過實(shí)時(shí)熒光定量 PCR檢

6、測(cè)中 miR-451相對(duì)表達(dá)水平；用生物信息學(xué)方法，預(yù)測(cè)并篩選 miR-451的靶基因 LMP7，并通過實(shí)時(shí)熒光定量 PCR和western blot檢測(cè)糖尿病腎病db/db小鼠腎皮質(zhì)中以及高糖和低糖條件下培養(yǎng)的小鼠腎小球系膜細(xì)胞LMP7內(nèi)源性表達(dá)變化；用實(shí)時(shí)熒光定量 PCR檢測(cè)轉(zhuǎn)染 miR-451 mimics和 inhibitor后miR-451和LMP7 mRNA的相對(duì)表達(dá)水平；western blot檢測(cè)LMP7蛋白的相對(duì)表達(dá)水

7、平；構(gòu)建靶基因結(jié)合位點(diǎn)的野生型和突變型 LMP7表達(dá)質(zhì)粒，將這些質(zhì)粒和miR-451 mimics或者mimics NC共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，用雙熒光素酶報(bào)告基因驗(yàn)證miR-451和LMP73’ UTR靶向關(guān)系。
　　結(jié)果： miR-451在糖尿病腎病小鼠腎臟和高糖培養(yǎng)的小鼠系膜細(xì)胞中相對(duì)表達(dá)水平明顯下降（p<0.05）；LMP7在糖尿病腎病小鼠和高糖培養(yǎng)的小鼠系膜細(xì)胞中相對(duì)表達(dá)水平明顯增高（p<0.05）；轉(zhuǎn)染miR-451 mi

8、mics和 inhibitor可以有效的上調(diào)和抑制 miR-451相對(duì)表達(dá)水平（p<0.05）；經(jīng)過預(yù)測(cè)、qRT-PCR、western blot和雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)顯示 miR-451可以與靶基因 LMP73’UTR靶向結(jié)合，并且miR-451顯著調(diào)節(jié)LMP7的mRNA和蛋白相對(duì)表達(dá)水平（p<0.05）。
　　結(jié)論： miR-451相對(duì)表達(dá)水平的異常下降和小鼠糖尿病腎病密切相關(guān)；miR-451通過與靶基因LMP73’ UTR

9、結(jié)合調(diào)節(jié)LMP7的表達(dá)。
　　第二部分 miR-451通過調(diào)節(jié)LMP7/NF-κB信號(hào)通路影響小鼠系膜細(xì)胞促炎癥因子的表達(dá)
　　目的：探討調(diào)節(jié)miR-451的表達(dá)對(duì)LMP7/NF-κB信號(hào)途徑激活的調(diào)控及NF-κB轉(zhuǎn)錄因子下游的促炎癥因子轉(zhuǎn)錄影響；了解miR-451對(duì)腎纖維化的影響。
　　方法：通過 western blot檢測(cè)小鼠系膜細(xì)胞在高糖條件下轉(zhuǎn)染miR-451 mimics對(duì)NF-κB轉(zhuǎn)錄因子關(guān)鍵蛋白p-Iκ

10、B、IκB和p65相對(duì)表達(dá)水平的影響；通過western blot檢測(cè)小鼠系膜細(xì)胞在低糖條件下轉(zhuǎn)染miR-451 inhibitor對(duì)NF-κB轉(zhuǎn)錄因子關(guān)鍵蛋白p-IκB、IκB和p65相對(duì)表達(dá)水平的影響；細(xì)胞免疫熒光化學(xué)定位小鼠系膜細(xì)胞中轉(zhuǎn)染miR-451 mimics和 inhibitor對(duì) p65進(jìn)入細(xì)胞核情況的影響；western blot檢測(cè)PR-957抑制LMP7的活性后調(diào)節(jié)miR-451的表達(dá)對(duì)NF-κB轉(zhuǎn)錄因子關(guān)鍵蛋白相

11、對(duì)表達(dá)水平的影響；通過實(shí)時(shí)熒光定量 PCR和ChIP檢測(cè)調(diào)節(jié)miR-451的表達(dá)對(duì)NF-κB轉(zhuǎn)錄因子與下游的促炎癥因子基因TNF-α、IL-18、MYD88和 ICAM-1啟動(dòng)子的結(jié)合以及轉(zhuǎn)錄的影響；通過實(shí)時(shí)熒光定量 PCR檢測(cè)調(diào)節(jié) miR-451的表達(dá)對(duì)促纖維化因子 TGF-β1、FN、collagen I和collagen IV轉(zhuǎn)錄mRNA的影響。
　　結(jié)果： western blot結(jié)果顯示，miR-451 mimics可以

12、抑制IκB磷酸化形成 p-IκB降解從而導(dǎo)致細(xì)胞核內(nèi) p65相對(duì)表達(dá)水平明顯降低（p<0.05），而miR-451 inhibitor可以促進(jìn)IκB磷酸化形成p-IκB降解從而引起細(xì)胞核內(nèi)p65相對(duì)表達(dá)水平明顯升高（p<0.05）；細(xì)胞免疫熒光化學(xué)顯示，miR-451 mimics可以抑制 p65蛋白向細(xì)胞內(nèi)內(nèi)轉(zhuǎn)移而miR-451 inhibitor可以促進(jìn) p65蛋白向細(xì)胞內(nèi)內(nèi)轉(zhuǎn)移；實(shí)時(shí)熒光定量PCR和 ChIP檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn) miR-

13、451 mimics可以抑制 p65蛋白與TNF-α、IL-18、MYD88和 ICAM-1啟動(dòng)子的結(jié)合并抑制它們的轉(zhuǎn)錄（p<0.05），而miR-451 inhibitor可以促進(jìn)p65蛋白與TNF-α、IL-18、MYD88和 ICAM-1啟動(dòng)子的結(jié)合并促進(jìn)它們的轉(zhuǎn)錄（ p<0.05）；miR-451 mimics和inhibitor可以抑制或者促進(jìn)纖維化因子TGF-β1、FN、collagen I和collagen IV的轉(zhuǎn)錄（p

14、<0.05）。
　　結(jié)論： miR-451通過抑制靶基因LMP7從而抑制NF-κB轉(zhuǎn)錄因子的活性，導(dǎo)致NF-κB轉(zhuǎn)錄因子與下游的促炎癥因子TNF-α、IL-18、MYD88和 ICAM-1基因啟動(dòng)子的結(jié)合能力降低，從而引起促炎癥因子轉(zhuǎn)錄降低；同時(shí) miR-451也抑制了促纖維化因子 TGF-β1、FN、collagen I和collagen IV轉(zhuǎn)錄。
　　第三部分 miR-451調(diào)控糖尿病腎病小鼠LMP7/NF-κB信號(hào)通

15、路的研究
　　目的：上調(diào)miR451在db/db糖尿病腎病小鼠體內(nèi)對(duì)LMP7/NF-κB信號(hào)途徑和促炎癥因子轉(zhuǎn)錄的影響，并且觀察上調(diào)miR451對(duì)db/db小鼠尿微量白蛋白、血糖、腎小球肥大，系膜擴(kuò)增以及腎纖維化的影響，為探索 miR-451調(diào)控糖尿病腎病分子機(jī)制提供理論基礎(chǔ)。
　　方法：通過尾靜脈注射 miR-451 agomir到已經(jīng)發(fā)生糖尿病腎病的db/db小鼠體內(nèi)，監(jiān)測(cè)血糖和尿微量白蛋白的變化，直到經(jīng)過miR-451

16、治療的db/db小鼠血糖和尿微量白蛋白顯著低于未治療的db/db小鼠；通過實(shí)時(shí)熒光定量 PCR檢測(cè)miR-451在各組db/db小鼠腎臟中的相對(duì)表達(dá)水平；通過實(shí)時(shí)熒光定量 PCR和western blot檢測(cè)LMP7在各組db/db小鼠腎臟中的相對(duì)表達(dá)水平；western blot檢測(cè)各組db/db小鼠腎臟中NF-κB轉(zhuǎn)錄因子關(guān)鍵蛋白p-IκB、IκB和p65相對(duì)表達(dá)水平；通過實(shí)時(shí)熒光定量 PCR檢測(cè)促炎癥因子TNF-α、IL-18、M

17、YD88和 ICAM-1相對(duì)表達(dá)水平；各組腎組織經(jīng)過H&E染色后觀察并統(tǒng)計(jì)腎小球肥大和系膜擴(kuò)增的情況；各組腎組織經(jīng)過Masson染色后觀察腎纖維化的情況，并通過實(shí)時(shí)熒光定量 PCR檢測(cè)促纖維化因子TGF-β1、FN、collagen I和collagen IV的相對(duì)表達(dá)水平。
　　結(jié)果：在miR-451 agomir治療的糖尿病腎病db/db小鼠中miR-451的相對(duì)表達(dá)水平明顯高于沒有注射miR-451的db/db小鼠（p<0.

18、05）；經(jīng)過miR-451 agomir治療后，LMP7的相對(duì)表達(dá)水平和NF-κB轉(zhuǎn)錄因子的活性明顯受到了抑制（p<0.05）；經(jīng)過miR-451 agomir治療后，促炎癥因子 TNF-α、IL-18、MYD88和 ICAM-1相對(duì)表達(dá)水平在糖尿病腎病db/db小鼠腎臟組織中明顯下降（p<0.05）；上調(diào)miR-451可以降低血糖和尿微量白蛋白，改善腎小球肥大、系膜擴(kuò)增以及腎纖維化，抑制促纖維化因子TGF-β1、FN、collagen