基于高通量功能篩選的miR-451調(diào)控胃癌生物學(xué)行為的機(jī)制研究.pdf

1、本文主要從以下幾部分進(jìn)行論述：
　　第一部分:高通量功能篩選對(duì)胃癌細(xì)胞遷移有影響的miRNA
　　目的:
　　高通量功能篩選與胃癌細(xì)胞遷移相關(guān)的miRNA。
　　方法:
　　通過(guò)SAMcell技術(shù)在人胃癌細(xì)胞系SGC-7901中對(duì)100種miRNA進(jìn)行高通量功能篩選。
　　結(jié)果:
　　確定了22種在胃癌中有功能的miRNA，其中15種抑制遷移，7種促進(jìn)遷移，在抑制遷移的miRNA中，相對(duì)于對(duì)照組

2、，miR-451的差異倍數(shù)最低。
　　結(jié)論:
　　在待選miRNA中，miR-451明顯影響胃癌細(xì)胞生物學(xué)行為。
　　第二部分:胃癌組織及胃癌細(xì)胞系中miR-451的表達(dá)
　　目的:
　　檢測(cè)miR-451在胃癌組織及其配對(duì)的癌旁正常組織中的表達(dá)差異。檢測(cè)miR-451在正常胃黏膜上皮細(xì)胞株及三種胃癌細(xì)胞株中的表達(dá)量。
　　方法:
　　收集20例胃癌患者手術(shù)切除標(biāo)本，利用RT-qPCR檢測(cè)miR

3、-451在胃癌組織及其配對(duì)的癌旁正常組織中的表達(dá)差異情況。提取GES-1、BGC-823、HGC-27、SGC7901細(xì)胞株中的RNA，用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)miR-451的表達(dá)。
　　結(jié)果:
　　1、miR-451在癌組織中的表達(dá)顯著低于配對(duì)的癌旁正常組織。
　　2、miR-451在胃癌細(xì)胞系中的表達(dá)低于正常胃黏膜上皮細(xì)胞株GES-1。
　　結(jié)論:
　　miR-451在胃癌中表達(dá)下調(diào)，提示其可能在胃癌發(fā)

4、生發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮重要作用。
　　第三部分:miR-451對(duì)胃癌細(xì)胞生物學(xué)功能的影響
　　目的:
　　研究miR-451對(duì)胃癌SGC-7901細(xì)胞增殖、凋亡、細(xì)胞周期、遷移、侵襲、EMT等生物學(xué)行為的影響。
　　方法:
　　應(yīng)用瞬時(shí)轉(zhuǎn)染的方法將miR-451轉(zhuǎn)入胃癌細(xì)胞株以獲得高表達(dá)的miR-451的細(xì)胞模型，并用RT-qPCR驗(yàn)證轉(zhuǎn)染效果;然后用CCK-8方法及EDU方法檢測(cè)腫瘤細(xì)胞的增殖情況，用Annex

5、inⅤ/PI雙染通過(guò)流式細(xì)胞儀檢測(cè)凋亡，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期變化，用transwell試驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移和侵襲，通過(guò)免疫熒光檢測(cè)細(xì)胞中上皮細(xì)胞標(biāo)志物(E-cadherin)和間充質(zhì)標(biāo)志物(vimentin)的表達(dá)，來(lái)反映EMT過(guò)程。
　　結(jié)果:
　　1、選擇SGC-7901細(xì)胞作為體外細(xì)胞模型，利用Real-time qPCR檢測(cè)轉(zhuǎn)染miR-451 mimics和陰性對(duì)照48h后miR-451的表達(dá)，結(jié)果顯示:轉(zhuǎn)染miR-

6、451 mimics后SGC-7901細(xì)胞中miR-451的表達(dá)水平較陰性對(duì)照組顯著增高(P＜0.01)。
　　2、CCK8方法和EDU方法均提示在胃癌細(xì)胞SGC-7901中，miR-451表達(dá)水平的上調(diào)可抑制細(xì)胞增殖。
　　3、流式細(xì)胞儀分析雙染AnnexinⅤ和PI的SGC-7901細(xì)胞凋亡比例，結(jié)果顯示:miR-451 mimics實(shí)驗(yàn)組的凋亡細(xì)胞比例為21.36％，而陰性對(duì)照組有6.87％的細(xì)胞發(fā)生了凋亡，表明miR

7、-451可以誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞凋亡。
　　4、流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期，結(jié)果示:miR-451 mimics實(shí)驗(yàn)組的G1/G0期、S期和G2/M期的比例分別為55.31％、21.62％和19.89％，而陰性對(duì)照組三期的比例分別為45.76％、22.97％和26.87％，表明miR-451表達(dá)水平的上調(diào)可阻滯細(xì)胞于G1期。
　　5、用transwell遷移實(shí)驗(yàn)檢測(cè)過(guò)表達(dá)miR-451對(duì)SGC-7901細(xì)胞遷移能力的影響，結(jié)果示: mi

8、R-451 mimics實(shí)驗(yàn)組遷移細(xì)胞數(shù)為(343.3±6.6)個(gè)，而陰性對(duì)照組為(520.6±7.6)個(gè)，兩組之間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。表明miR-451可以抑制胃癌細(xì)胞遷移。
　　6、用transwell侵襲實(shí)驗(yàn)檢測(cè)過(guò)表達(dá)miR-451對(duì)SGC-7901細(xì)胞侵襲能力的影響，結(jié)果示: miR-451 mimics實(shí)驗(yàn)組侵襲細(xì)胞數(shù)為(373.3±7.6)個(gè)，而陰性對(duì)照組為(523.3±13.3)個(gè)，兩組之間比較差異

9、有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。表明miR-451可以抑制胃癌細(xì)胞侵襲。
　　7、和陰性對(duì)照組相比，miR-451 mimics實(shí)驗(yàn)組中E-cadherin的表達(dá)增高，vimentin的表達(dá)降低，表明miR-451可以起到抑制EMT過(guò)程的作用。
　　結(jié)論:
　　miR-451在胃癌細(xì)胞中發(fā)揮抑癌作用，影響胃癌的增殖、凋亡、轉(zhuǎn)移等生物學(xué)行為。
　　第四部分: miR-451靶基因的預(yù)測(cè)和驗(yàn)證
　　目的:

10、　　尋找miR-451的靶基因，為深入研究miR-451的分子機(jī)制奠定基礎(chǔ)。
　　方法:
　　應(yīng)用生物信息學(xué)軟件對(duì)miR-451的靶基因進(jìn)行預(yù)測(cè)和篩選，利用雙熒光素酶報(bào)告基因方法驗(yàn)證預(yù)測(cè)的靶基因，運(yùn)用RT-qPCR和western blot檢測(cè)過(guò)表達(dá)miR-451后ERK2分別在mRNA和蛋白水平表達(dá)的變化。
　　結(jié)果:
　　1、應(yīng)用生物信息學(xué)軟件對(duì)miR-451的靶基因進(jìn)行預(yù)測(cè)，結(jié)果示:ERK2可能為miR-4

11、51的靶基因。
　　2、雙熒光素酶報(bào)告基因方法證明miR-451可以靶向作用于ERK2的3'UTR。
　　3、RT-qPCR和western blot證明SGC-7901細(xì)胞過(guò)表達(dá)miR-451后，ERK2在mRNA和蛋白水平的表達(dá)均下調(diào)。
　　結(jié)論:
　　在胃癌中，ERK2是miR-451的下游靶基因。
　　第五部分:沉默ERK2對(duì)胃癌細(xì)胞生物學(xué)功能的影響
　　目的:
　　研究miR-451的

12、下游靶基因ERK2對(duì)胃癌SGC-7901細(xì)胞增殖、凋亡、周期、遷移、侵襲、EMT等生物學(xué)行為的影響，分析miR-451是否是通過(guò)ERK2影響胃癌細(xì)胞生物學(xué)行為。
　　方法:
　　首先合成ERK2的siRNA，分別用實(shí)時(shí)熒光定量PCR和western blot在mRNA和蛋白水平驗(yàn)證其沉默效率，應(yīng)用瞬時(shí)轉(zhuǎn)染的方法將其轉(zhuǎn)入SGC-7901胃癌細(xì)胞以獲得低表達(dá)的ERK2細(xì)胞模型，然后用CCK-8方法及EDU方法檢測(cè)腫瘤細(xì)胞的增殖情

13、況，用AnnexinⅤ/PI雙染通過(guò)流式細(xì)胞儀檢測(cè)凋亡，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期變化，用transwell試驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移和侵襲，通過(guò)免疫熒光檢測(cè)細(xì)胞中上皮細(xì)胞標(biāo)志物(E-cadherin)和間充質(zhì)標(biāo)志物(vimentin)的表達(dá)，來(lái)反映EMT過(guò)程。
　　結(jié)果:
　　1、RT-qPCR和Western blot結(jié)果示:轉(zhuǎn)染ERK2 siRNA后，ERK2在mRNA水平和蛋白水平的表達(dá)較陰性對(duì)照組均顯著降低。
　　2、C

14、CK8方法和EDU方法均提示在胃癌細(xì)胞SGC-7901中，沉默ERK2可抑制SGC-7901細(xì)胞增殖。
　　3、流式細(xì)胞儀分析雙染AnnexinⅤ和PI的SGC-7901細(xì)胞凋亡比例，結(jié)果顯示:si-ERK2實(shí)驗(yàn)組的凋亡細(xì)胞比例為13.96％，而陰性對(duì)照組有6.87％的細(xì)胞發(fā)生了凋亡，表明下調(diào)ERK2的表達(dá)可以誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞凋亡。
　　4、流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期，結(jié)果示:si-ERK2實(shí)驗(yàn)組的G1/G0期、S期和G2/M期的比

15、例分別為55.29％、21.73％和19.11％，而陰性對(duì)照組三期的比例分別為45.76％、22.97％和26.87％，表明下調(diào)ERK2的表達(dá)可阻滯細(xì)胞于G1期。
　　5、用transwell遷移實(shí)驗(yàn)檢測(cè)沉默ERK2對(duì)SGC-7901細(xì)胞遷移能力的影響，結(jié)果示:si-ERK2實(shí)驗(yàn)組遷移細(xì)胞數(shù)為(454±12.0)個(gè)，而陰性對(duì)照組為(520.6±7.6)個(gè)，兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.05)。表明ERK2表達(dá)水平的下調(diào)可以抑制

16、胃癌細(xì)胞遷移。
　　6、用transwell侵襲實(shí)驗(yàn)檢測(cè)沉默ERK2對(duì)SGC-7901細(xì)胞侵襲能力的影響，結(jié)果顯示:si-ERK2實(shí)驗(yàn)組侵襲細(xì)胞數(shù)為(410.7±24.1)個(gè)，而陰性對(duì)照組為(523.3±13.3)個(gè)，兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.05)。表明ERK2表達(dá)水平的下調(diào)可以抑制胃癌細(xì)胞侵襲。
　　7、和陰性對(duì)照組相比，si-ERK2實(shí)驗(yàn)組中E-cadherin的表達(dá)增高，vimentin的表達(dá)降低，表明沉默E