X盒結(jié)合蛋白1在胃癌中的表達(dá)及其對胃癌生物學(xué)行為的調(diào)控機(jī)制.pdf

1、胃癌是威脅人類健康的嚴(yán)重疾病，近年來其發(fā)病率、致死率居高不下。2012年全球胃癌新發(fā)病例951000例，發(fā)病率在所有腫瘤中排在第5位。我國是胃癌的高發(fā)區(qū)，2012年新增胃癌病例數(shù)居世界首位，嚴(yán)重影響居民健康的同時，給國家醫(yī)療衛(wèi)生資源造成了沉重負(fù)擔(dān)。目前胃癌治療有外科手術(shù)、化療、放療、生物靶向治療、免疫治療及中醫(yī)中藥治療等多種手段，且各種治療方法不斷日臻完善，但由于部分患者起病隱匿、衛(wèi)生保健意識薄弱、缺乏有效簡便的篩查方法，我國早期胃癌總

2、體檢出率較低，多數(shù)患者診斷時已處于進(jìn)展期，因此盡管醫(yī)療診治水平不斷提高，胃癌患者五年生存率仍不理想，總體預(yù)后并未見明顯改善。進(jìn)一步探索胃癌生物學(xué)行為的分子機(jī)制，為胃癌患者的預(yù)后評判及治療提供新的指標(biāo)和靶點顯得尤為重要。
　　X盒結(jié)合蛋白1（X-box binding protein-1，XBP1）是真核細(xì)胞中重要的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，是未折疊蛋白反應(yīng)(Unfolded protein response，UPR)信號通路的重要組件。細(xì)胞處

3、于缺氧、營養(yǎng)缺乏及氧化應(yīng)激等不利的微環(huán)境中時，其內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中蛋白質(zhì)折疊組裝過程可發(fā)生障礙，導(dǎo)致大量未折疊或錯誤折疊的蛋白質(zhì)在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中異常積聚，進(jìn)一步引發(fā)一系列細(xì)胞內(nèi)應(yīng)力信號傳導(dǎo)事件的級聯(lián)應(yīng)激反應(yīng)，稱之為未折疊蛋白反應(yīng)，旨在通過激活細(xì)胞適應(yīng)性信號通路促進(jìn)細(xì)胞存活或通過誘導(dǎo)細(xì)胞死亡程序促進(jìn)細(xì)胞凋亡。Inositol-requiring enzyme1α(IRE1α)/X-box binding protein-1(XBP1)通路是UPR中三條主

4、要信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路之一，在此過程中，IRE1α利用其核酸內(nèi)切酶活性對編碼XBP1 mRNA進(jìn)行非常規(guī)的剪接，產(chǎn)生的Spliced XBP1 mRNA翻譯出活性形式的X盒結(jié)合蛋白1(XBP1s)，XBP1s進(jìn)入細(xì)胞核調(diào)控一系列靶基因的表達(dá)，以促進(jìn)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中未折疊或錯誤折疊蛋白質(zhì)的重新折疊或降解，消除內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的應(yīng)激狀態(tài)，促進(jìn)細(xì)胞存活。
　　腫瘤細(xì)胞生長代謝旺盛，支配其生長的氧及營養(yǎng)物質(zhì)來源于血供。隨著腫瘤生長，其內(nèi)部血管生成需要一定的時間。當(dāng)

5、血管生長滯后于腫瘤生長時，血供不能完全滿足腫瘤細(xì)胞生長增殖對氧及營養(yǎng)物質(zhì)的需求，細(xì)胞便會處于低氧狀態(tài)，影響其內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中蛋白質(zhì)的折疊組裝過程，導(dǎo)致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，引發(fā)未折疊蛋白反應(yīng)(UPR)。目前研究證實，在多種腫瘤細(xì)胞中存在著內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和UPR的激活，并且它們與癌細(xì)胞的存活和抗癌治療的抵抗是相互關(guān)聯(lián)的。在乳腺癌、肝癌、胃部腫瘤和食道腺癌中已經(jīng)檢測到UPR組件的過表達(dá)，如78kDa glucose regulated protein(GRP78

6、)、94kDa glucoseregulated protein(GRP94)等。而研究證實GRP78等UPR組件與多種癌癥的預(yù)后相關(guān)。XBP1在乳腺癌中的表達(dá)上調(diào)，且其與乳腺癌細(xì)胞的快速生長、對內(nèi)分泌治療的抵抗和較低的患者生存率相關(guān)。另有動物實驗顯示，缺乏XBP1可以顯著抑制腫瘤的形成和發(fā)展。因此，進(jìn)一步探索XBP1在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用頗具意義。而目前尚未見XBP1在胃癌標(biāo)本中表達(dá)狀況或其在胃癌發(fā)生發(fā)展過程中作用的相關(guān)研究。本課題通

7、過檢測臨床胃癌標(biāo)本中XBP1的表達(dá)狀況，分析XBP1與胃癌患者臨床病理特征之間的關(guān)系及其對胃癌患者預(yù)后的影響，進(jìn)一步利用胃癌細(xì)胞系研究XBP1對胃癌細(xì)胞增殖、凋亡、遷移及侵襲的影響并探索內(nèi)在分子機(jī)制，旨在為胃癌患者的預(yù)后評判和治療提供一個新的指標(biāo)和靶點。
　　第一部分 X盒結(jié)合蛋白1在胃癌中的表達(dá)狀況及其對患者預(yù)后的影響
　　目的:檢測X盒結(jié)合蛋白1在胃癌中的表達(dá)狀況，分析其與胃癌患者臨床病理特征、預(yù)后之間的關(guān)系。
　

8、　方法:分別利用逆轉(zhuǎn)錄PCR和Western blot技術(shù)檢測新鮮胃癌組織和相應(yīng)癌旁組織、正常胃黏膜組織中XBP1在mRNA水平和蛋白水平的表達(dá)狀況，對比三種組織之間的表達(dá)差異;免疫組織化學(xué)技術(shù)檢測XBP1在30例胃癌組織標(biāo)本、30例癌旁組織標(biāo)本、30例胃潰瘍組織標(biāo)本和30例正常胃黏膜組織標(biāo)本中的表達(dá)狀況，對比分析XBP1在不同組織之間的表達(dá)差異;免疫組化技術(shù)檢測208例胃癌標(biāo)本XBP1表達(dá)狀況，分析其與胃癌患者臨床病理因素之間的關(guān)系，

9、及其對患者預(yù)后的影響。統(tǒng)計分析采用SPSS19.0軟件，P＜0.05有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　結(jié)果:逆轉(zhuǎn)錄PCR和Western blot檢測發(fā)現(xiàn)無論是mRNA水平還是蛋白水平，XBP1在胃癌組織中的表達(dá)均高于癌旁組織及正常胃黏膜組織，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。免疫組化結(jié)果顯示各30例標(biāo)本中，胃癌XBP1高表達(dá)者22例、癌旁組織XBP1高表達(dá)者10例、胃潰瘍組織XBP1高表達(dá)者12例、正常胃黏膜組織XBP1高表達(dá)者9例。胃癌中X

10、BP1高表達(dá)率高于其他各組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。癌旁組織、胃潰瘍組織、正常胃黏膜組織的XBP1高表達(dá)率差異無統(tǒng)計學(xué)意義。208例胃癌標(biāo)本中，XBP1高表達(dá)者129例，低表達(dá)者79例?？ǚ綑z驗分析發(fā)現(xiàn)XBP1表達(dá)水平與胃癌浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期相關(guān)(P＜0.05)，與患者接受手術(shù)時年齡、性別、血型、腫瘤部位等不相關(guān)(P＞0.05)。Spearman秩相關(guān)分析提示XBP1表達(dá)水平與胃癌浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期

11、呈正相關(guān)(P＜0.05)。Kaplan-Meier生存分析顯示XBP1高表達(dá)組中位生存期25個月，XBP1低表達(dá)組中位生存期60個月，Log-rank檢驗兩組5年生存率差異有顯著統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。
　　結(jié)論:XBP1在胃癌中高表達(dá)率高于非癌胃組織;XBP1在胃癌中的表達(dá)與胃癌浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期呈正相關(guān)。XBP1低表達(dá)組胃癌患者預(yù)后優(yōu)于高表達(dá)組患者，XBP1是胃癌患者預(yù)后的獨立影響因素之一。
　　第二部

12、分 X盒結(jié)合蛋白1對胃癌細(xì)胞增殖、凋亡、遷移、侵襲的影響及其機(jī)制
　　目的:研究XBP1對胃癌細(xì)胞增殖、凋亡、遷移及侵襲等生物學(xué)行為的影響并初步探索其內(nèi)在分子機(jī)制
　　方法:選用AGS胃癌細(xì)胞系，分別用腫瘤細(xì)胞增殖實驗（MTT法）、凋亡實驗、趨化實驗、侵襲實驗研究干擾XBP1表達(dá)對胃癌細(xì)胞增殖、凋亡、遷移及侵襲的影響;低氧(0.1％O2)條件下培養(yǎng)AGS細(xì)胞，利用染色質(zhì)免疫共沉淀技術(shù)(CHIP)檢測該細(xì)胞XBP1表達(dá)與VEG

13、Fa、MMP9、COX2、MMP2基因之間的關(guān)聯(lián);免疫共沉淀方法(Co-IP)檢測XBP1與HIF1兩個蛋白分子之間在是否存在相互作用。
　　結(jié)果:與陰性對照組相比，si-XBP1組胃癌細(xì)胞增殖率下降、凋亡增加、遷移及侵襲能力減弱，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。沉默XBP1表達(dá)后細(xì)胞中VEGFa mRNA、COX2mRNA、MMP2 mRNA含量明顯減少，MMP9 mRNA含量減少。XBP1與VEGFa、MMP9、COX2、MMP2基因相互結(jié)