MACF1在胃癌中的表達(dá)及CRISPR-Cas9敲除MACF1對胃癌體外生物學(xué)行為的影響.pdf_第1頁
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文檔簡介

1、胃癌(gastric cancer, GC)是全球死亡率第二位的惡性腫瘤,胃癌的發(fā)病率高,治療效果差,根治率低,在消化道腫瘤中發(fā)病率和死亡率占第一位,是危害人類健康的主要惡性腫瘤之一。
  本研究擬探討MACF1在胃癌中的表達(dá)情況及預(yù)后的關(guān)系,為胃癌的早期診斷和治療提供理論依據(jù)。并采用CRISPR/Cas9基因打靶技術(shù),敲除胃癌細(xì)胞系中的MACF1基因的表達(dá),觀察細(xì)胞生物學(xué)行為及功能的變化,從而研究MACF1在胃癌發(fā)生發(fā)展機(jī)制中的

2、作用。
  本研究主要分為以下三個部分:
  第一部分:MACF1在胃癌中的表達(dá)情況及與臨床預(yù)后之間的關(guān)系
  目的:
  探討MACF1蛋白在胃癌組織中的表達(dá)情況及其與臨床病理學(xué)特征和臨床預(yù)后之間的關(guān)系
  方法:
  1.構(gòu)建組織芯片并采用免疫組化法(IHC)檢測MACF1在107例胃癌組織及107例相對應(yīng)正常組織的胃癌上皮中的表達(dá)情況;
  2.對所有患者進(jìn)行隨訪,獲得5年隨訪資料,并結(jié)合

3、MACF1在胃癌上皮組織中的表達(dá)情況,分析MACF1表達(dá)與臨床病理和預(yù)后之間的關(guān)系;
  3.免疫組化結(jié)果分析和判定:每張芯片免疫組化結(jié)果均由3位病理科醫(yī)師進(jìn)行雙盲評價,芯片上的每個點評價至少5個高倍視野,每個高倍視野下的細(xì)胞不應(yīng)少于100個。然后根據(jù)免疫組化的著色強(qiáng)度和著色范圍進(jìn)行綜合評價。
  4.統(tǒng)計學(xué)處理:應(yīng)用SPSS21.0統(tǒng)計分析軟件對所得實驗數(shù)據(jù)進(jìn)行處理。采用Spearman相關(guān)分析進(jìn)行有序變量之間的聯(lián)系的分析

4、,采用Pearson's卡方檢驗分類變量之間的比較;采用Kaplan-Meier法分析MACF1表達(dá)與胃癌患者生存預(yù)后之間的關(guān)系并繪制生存曲線,采用log-rank檢驗比較組間的差異;采用Cox風(fēng)險模型進(jìn)行多因素分析,評估各個指標(biāo)對患者的預(yù)后生存的獨立影響,包括患者的年齡、性別、腫瘤大小、浸潤深度、分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等等,從而分析與胃癌患者預(yù)后生存相關(guān)的獨立危險因素。P<0.05時有統(tǒng)計學(xué)差異,雙側(cè)檢驗。
  結(jié)果:
  1.

5、免疫組化結(jié)果顯示:在107例胃癌癌旁正常組織中,24例染色陽性(22.4%),83例染色陰性(77.6%);107例胃癌組織中,76例染色陽性(71.0%),31例染色陰性(29.0%)。MACF1蛋白在胃癌組織中的表達(dá)率為71%(76/107),明顯高于其相應(yīng)的癌旁正常胃粘膜組織22.4%(24/107),且差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(p<0.05);
  2.MACF1過表達(dá)與腫瘤浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)和腫瘤分期密切相關(guān),并有統(tǒng)計學(xué)意義(

6、p<0.05);
  3.總體胃癌術(shù)后患者5年生存生存率42.5%(45/107),MACF1蛋白表達(dá)升高的胃癌患者的5年生存率35.2%(25/76)明顯低于MACF1蛋白低表達(dá)的胃癌患者的5年生存率55.6%(20/31),且差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(p=0.034);
  4.MACF1的過表達(dá)、臨床分期、淋巴結(jié)的轉(zhuǎn)移個數(shù)都是胃癌患者術(shù)后總體生存率的獨立預(yù)后因素。
  第二部分:CRISPR/Cas9靶向敲除MACF1

7、基因改造胃癌細(xì)胞系
  目的:
  探討MACF1在不同胃癌細(xì)胞系中的表達(dá)情況及并利用CRISPR/Cas9基因打靶技術(shù)靶向敲除MACF1以獲得突變型胃癌細(xì)胞系。
  方法:
  1.采用熒光實時定量PCR(Q-PCR)和蛋白印跡(Western-blot)的方法檢測MACF1在5個不同的胃癌細(xì)胞系A(chǔ)GS、HGC-27、SNU-1、KATO-Ⅲ、NCI-N87中的表達(dá)情況,篩選表達(dá)量較高的細(xì)胞系;
  2.

8、MACF1 CRISPR/Cas9載體構(gòu)建:將MACF1的全基因組序列輸入Vector NTI軟件中,選定合適外顯子并在Zifit工具網(wǎng)站中獲取合適的sgRNA序列,并加入BsaⅠ酶切位點,CRISPR/Cas9及引導(dǎo)的sgRNA轉(zhuǎn)染目的細(xì)胞后,Cas9在切割基因組的同時也會切割同樣含有靶序列的質(zhì)粒reporter,將sgRNA和reporter合成后,稀釋退火,連接轉(zhuǎn)化、挑菌、擴(kuò)大培養(yǎng),質(zhì)粒提取;
  3.通過轉(zhuǎn)染EGFP綠色熒

9、光蛋白,篩選轉(zhuǎn)染質(zhì)粒與Lip2000的最佳轉(zhuǎn)染比例:質(zhì)粒的質(zhì)量與Lip2000體積比例分別為1∶1、1∶2、1∶3、1∶4、1∶5,轉(zhuǎn)染48小時后觀察細(xì)胞轉(zhuǎn)染情況,選取最佳轉(zhuǎn)染比例;
  4.使用Lip2000分別將sgRNA、reporter、cas9轉(zhuǎn)染進(jìn)JH293工具細(xì)胞,篩選切割效率較高的sgRNA;
  5.使用Lip2000分別將切割效率較高的sgRNA、reporter、cas9轉(zhuǎn)染進(jìn)工具細(xì)胞目的細(xì)胞AGS、S

10、NU-1,48小時后觀察轉(zhuǎn)染效率;
  6.流式分選細(xì)胞儀分選目的細(xì)胞:將轉(zhuǎn)染后細(xì)胞消化制備單細(xì)胞懸液,在流式細(xì)胞儀中分選單個目的細(xì)胞,種于96孔板中;
  7.單克隆細(xì)胞的培養(yǎng)及細(xì)胞收集:培養(yǎng)1-2周后,觀察96孔板中的單克隆細(xì)胞團(tuán),待96孔板中的細(xì)胞長至50%左右時,分至另一96孔板中。
  結(jié)果:
  1.Q-PCR和Western-blot結(jié)果顯示: MACF1在5個不同的胃癌細(xì)胞系A(chǔ)GS、HGC-27、

11、SNU-1、KATO-Ⅲ、NCI-N87等均有表達(dá),且Q-PCR與WB二者結(jié)果基本一致,均為NCI-N87表達(dá)量最高,其次為AGS、SNU-1、HGC-27、KATO-Ⅲ;
  2.成功構(gòu)建MACF1 CRISPR/Cas9載體,共構(gòu)建5個sgRNA、2個reporter,并轉(zhuǎn)化、搖菌、擴(kuò)大培養(yǎng),提取質(zhì)粒;
  3.質(zhì)粒與Lip2000最佳轉(zhuǎn)染比例分別為:AGS1∶2、HGC-271∶2、SNU-11∶3、KATO-Ⅲ1∶3

12、、NCI-N87的Lip2000轉(zhuǎn)染效率極低;
  4.JH293工具細(xì)胞篩選的sgRNA和reporter分別為reporter1、sgRNA2;
  5.成功將sgRNA2和reporter1轉(zhuǎn)染進(jìn)入AGS和SNU-1,48小時后流式分選
  6.流式分選AGS和SNU-1的單細(xì)胞懸液,種于96孔板中,每個細(xì)胞分別收集4個96孔板;
  7.單克隆細(xì)胞團(tuán)形成后,并長成96孔板的50%,分盤培養(yǎng),AGS細(xì)胞平均

13、單克隆形成率為19/96(19.79%),SNU-1細(xì)胞平均單克隆形成率為25/96(25.78%)。AGS細(xì)胞存活率48.68%; SNU-1細(xì)胞存活率46.46%。
  8.T7錯配酶切鑒定:37個AGS細(xì)胞株有10個酶切鑒定結(jié)果為陽性,陽性率27%; SNU-1共驗證8株,其中7個鑒定結(jié)果為陽性,陽性率為87.5%;將陽性的AGS和SNU-1全部送測序。
  9.DNA測序并篩選AGS野生細(xì)胞系2株,純合突變(正負(fù))2

14、株,雜合突變(負(fù)負(fù))5株;SNU野生細(xì)胞系2株,一條染色體敲除細(xì)胞系2株,兩條染色體同時敲除細(xì)胞系6株;
  10.Western-blot驗證得到的細(xì)胞株,MACF1基因純合突變細(xì)胞系蛋白表達(dá)缺失,MACF1雜合突變細(xì)胞系蛋白表達(dá)較MACF1野生型減少。
  第三部分:MACF1基因敲除對胃癌AGS細(xì)胞系體外生物學(xué)行為的影響
  目的:
  探討CRISPR/Cas9靶向敲除MACF1基因后對胃癌AGS細(xì)胞系生

15、物學(xué)行為的影響。
  方法:
  1.MTS法檢測敲除MACF1對胃癌AGS細(xì)胞增殖能力的影響;
  2.細(xì)胞劃痕實驗檢測敲除MACF1對胃癌AGS細(xì)胞的遷移能力的影響;
  3.平板克隆檢測敲除MACF1對胃癌AGS細(xì)胞的克隆形成能力的影響;
  4.軟瓊脂克隆形成檢測敲除MACF1對胃癌AGS細(xì)胞的克隆形成能力的影響;
  5.Transwell實驗檢測敲除MACF1對胃癌AGS細(xì)胞的遷移能力的影

16、響;
  6.流式細(xì)胞儀檢測敲除MACF1對胃癌AGS細(xì)胞周期的影響。
  結(jié)果:
  1.MACF1敲除后的胃癌AGS細(xì)胞形態(tài)變化,梭形變?yōu)轭悎A形;
  2.MTS結(jié)果顯示MACF1敲除后胃癌AGS細(xì)胞增殖能力減弱;
  3.細(xì)胞劃痕實驗結(jié)果顯示MACF1敲除后胃癌AGS細(xì)胞增殖能力減弱;
  4.平板克隆形成實驗結(jié)果顯示MACF1敲除后胃癌細(xì)胞克隆形成能力減弱;
  5.軟瓊脂克隆形成實驗結(jié)

17、果顯示MACF1敲除后胃癌細(xì)胞克隆形成能力減弱;
  6.Transwell結(jié)果顯示MACF1敲除后胃癌AGS細(xì)胞的遷移能力減弱;
  7.流式結(jié)果顯示MACF1敲除后細(xì)胞阻滯在G2/M有絲分裂期。
  結(jié)論:
  1.CRISPR/Cas9敲除MACF1基因的表達(dá)可以使胃癌細(xì)胞形態(tài)變化,細(xì)胞極性消失,形態(tài)由梭形變?yōu)轭悎A形,可能與MACF1蛋白參與細(xì)胞骨架形成有關(guān);
  2.CRISPR/Cas9敲除MAC

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