EB病毒LMP1通過JAK和MAPK通路介導(dǎo)STAT3調(diào)控VEGF的分子機(jī)制研究.pdf

1、VEGF是1989年Ferrara等在牛垂體濾泡星狀細(xì)胞體外培養(yǎng)液中首先純化出來的糖蛋白，它是內(nèi)皮細(xì)胞的特異性有絲分裂原，也是一種有效的血管形成和通透性誘導(dǎo)因子。VEGF與血管內(nèi)皮細(xì)胞的相應(yīng)受體結(jié)合，刺激血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖，同時(shí)還可以促進(jìn)血管內(nèi)物質(zhì)的泄露，為血管內(nèi)皮細(xì)胞的遷移和腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移提供基質(zhì)。VEGF在胃腸道原發(fā)腺癌、腎癌、乳腺癌、肺癌等許多腫瘤組織中高表達(dá)，并提示VEGF的表達(dá)與腫瘤細(xì)胞存活、侵襲轉(zhuǎn)移和血管生成密切相關(guān)。

2、 鼻咽癌是我國南方常見的惡性腫瘤之一。鼻咽癌臨床病理特點(diǎn)為低度分化和高轉(zhuǎn)移性，以頸部淋巴結(jié)為首發(fā)癥狀就診的病例可高達(dá)78.9％，而轉(zhuǎn)移的發(fā)生是影響病人預(yù)后的主要因素。前人研究發(fā)現(xiàn)，在鼻咽癌及鼻咽癌頸部淋巴轉(zhuǎn)移組織中VEGF明顯高于慢性鼻咽炎組織，表明VEGF可能在鼻咽癌的生長及轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用。因此闡明 VEGF 在鼻咽癌轉(zhuǎn)移機(jī)制中的作用具有非常重要的意義。 現(xiàn)已明確環(huán)境因素和遺傳因素協(xié)同作用是鼻咽癌發(fā)病的主要原因。在環(huán)境因

3、素方面，EB病毒與鼻咽癌的相關(guān)性已得到肯定。EB病毒編碼EBNA1、EBNA2、EBNA3A、EBNA3C和潛伏膜蛋白質(zhì)(latent membrane protein 1，LMP1)等各種瘤蛋白。其中LMP1是一個(gè)重要的致瘤蛋白，它通過其羧基端胞漿區(qū)介導(dǎo)幾條重要的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)通路的異常激活。其中LMP1的CTAR3(carboxyterminal activatingregion 3)參與活化JAK/STAT 通路。 我們前期的

4、研究初步表明LMP1可以誘導(dǎo)VEGF的表達(dá)，增強(qiáng)STAT3在VEGF啟動(dòng)子區(qū)一848位的結(jié)合能力。STAT3是一個(gè)受EB病毒LMP1調(diào)控的重要的轉(zhuǎn)錄因子，在其靶向的多種下游基因中，VEGF是一個(gè)重要的靶基因，從而為建立LMP1—STAT3—VEGF之間的內(nèi)在聯(lián)系提供了有意義的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。在此基礎(chǔ)上我們進(jìn)一步研究LMP1誘導(dǎo)VEGF表達(dá)的作用機(jī)制。我們前期工作進(jìn)一步證明了LMP1依靠CTAR2、CTAR3的協(xié)同作用，通過JAK3促進(jìn)酪氨酸7

5、05位STAT3磷酸化：并通過MAPK/ERK信號(hào)通路促進(jìn)絲氨酸727位STAT3磷酸化，LMP1調(diào)控STAT3核移位為705位Tyr磷酸化依賴性。LMP1還可以通過IL-6的自分泌上調(diào)STAT3的酪氨酸和絲氨酸磷酸化水平。我們的研究明確了EB病毒LMPl在JAK3，MAPK/ERK激酶活化中的功能，尤其是LMP1對(duì)STAT3調(diào)控的分子機(jī)制，為我們深入探討LMP1誘導(dǎo)VEGF表達(dá)的作用機(jī)制提供了實(shí)驗(yàn)證據(jù)。 基于以上前期研究的工作

6、基礎(chǔ)，我們確定了“在鼻咽癌細(xì)胞中EB病毒LMP1通過JAK/STAT和MAPK/ERK通路激活STAT3調(diào)控VEGF的分子機(jī)制研究”這一研究課題。 我們以EB病毒LMP1上調(diào)STAT3磷酸化為基礎(chǔ)，采用阻斷為主的策略研究LMP1介導(dǎo)STAT3信號(hào)通路對(duì)VEGF的調(diào)控機(jī)制。我們選擇了鼻咽癌細(xì)胞中LMP1表達(dá)陰性的CNE1細(xì)胞和穩(wěn)定表達(dá)LMP1的CNE1-LMP1細(xì)胞，根據(jù)LMP1調(diào)控STAT3信號(hào)通路的環(huán)節(jié)，從四個(gè)不同的層面來阻斷

7、STAT3信號(hào)通路。在LMP1層面，采用針對(duì)LMP1特異性的脫氧核酶DZ1阻斷LMP1；在JAK3層面，采用JAK3特異性的小分子抑制劑WHI-P131阻斷JAK3酪氨酸激酶活性；在ERK1/2層面，采用其上游激酶MEK1特異性小分子抑制劑PD98059阻斷ERK1/2的絲氨酸激酶活性；在STAT3層面，采用直接針對(duì)STAT3的反義寡核苷酸(ASO)和干擾RNA阻斷STAT3蛋白表達(dá)。 我們采用western blotting技

8、術(shù)來檢測(cè)LMP1對(duì)STAT3磷酸化水平的調(diào)節(jié)，采用報(bào)告基因策略來觀察JAK/STAT和MAPK/ERK通路對(duì)STAT的反式激活能力的影響。結(jié)果顯示特異性靶向LMP1的脫氧核酶DZ1能顯著抑制LMP1陽性鼻咽癌細(xì)胞中STAT3的磷酸化水平，而對(duì)STAT3總蛋白的表達(dá)沒有影響，并且脫氧核酶能夠有效地抑制LMP1誘導(dǎo)的STAT的反式激活能力；選擇性JAK3抑制劑WHI-P131阻斷JAK3/STAT信號(hào)通路的活化，呈劑量依賴性地抑制LMP1調(diào)

9、控JAK3激酶激活的STAT3酪氨酸磷酸化水平，而STAT3絲氨酸磷酸化水平以及STAT3總蛋白表達(dá)不受影響，并且JAK3/STAT信號(hào)通路的阻斷可以抑制STAT的反式激活能力；ERK上游激酶MEKl選擇性抑制劑PD98059阻斷ERK信號(hào)通路的活化后，呈劑量依賴性地抑制LMP1調(diào)控的ERK激酶激活的STAT3絲氨酸磷酸化水平，而STAT3酪氨酸磷酸化水平以及STAT3總蛋白表達(dá)不受影響，并且MAPK/ERK信號(hào)通路的阻斷可以抑制STA

10、T的反式激活能力，但其抑制程度弱于JAK3/STAT信號(hào)通路的阻斷后的抑制程度。無論是在CNE1還是CNE1-LMP1細(xì)胞中，轉(zhuǎn)染針對(duì)STAT3的siRNA100nm，72小時(shí)后，STAT3總蛋白表達(dá)被抑制，磷酸化STAT3水平也被抑制。針對(duì)STAT3的特異性反義寡核苷酸以序列特異性的方式抑制CNE1和CNE1-LMP1細(xì)胞系STAT3蛋白的表達(dá)，磷酸化STAT3水平也被顯著地抑制。這樣，我們進(jìn)一步證實(shí)了STAT3是一個(gè)受LMP1調(diào)控的

11、重要的轉(zhuǎn)錄因子。LMP1不僅調(diào)控STAT3的磷酸化，而且調(diào)節(jié)STAT的反式激活能力。并且進(jìn)一步驗(yàn)證了在LMP1調(diào)控下，JAK3介導(dǎo)的STAT3活化主要是酪氨酸705位；而MAPK/ERK則通過介導(dǎo)STAT3絲氨酸727位磷酸化位點(diǎn)活化STAT3。腫瘤細(xì)胞分泌的VEGF選擇性作用于血管內(nèi)皮細(xì)胞膜上的VEGFR，VEGF及其受體通過旁分泌途徑，聯(lián)合調(diào)控內(nèi)皮細(xì)胞分化和血管形成。因此，分泌到細(xì)胞外的VEGF是VEGF發(fā)揮作用的功能形式。在明確L

12、MP1調(diào)控STAT3的磷酸化和反式激活能力的基礎(chǔ)上，我們進(jìn)一步從四個(gè)層面阻斷LMP1、JAK3、MEK1、STAT3來觀察VEGF的表達(dá)和分泌。我們采用Western Blotting技術(shù)和ELISA方法研究發(fā)現(xiàn)特異性靶向LMP1的脫氧核酶能夠抑制鼻咽癌細(xì)胞中LMP1上調(diào)的VEGF蛋白表達(dá)和分泌．針對(duì)STAT3信號(hào)通路酪氨酸激酶JAK3的阻斷劑WHI-P131能顯著抑制LMP1誘導(dǎo)的VEGF蛋白的表達(dá)和分泌，且隨著WHI-P131濃度的

13、增加，呈明顯的量效關(guān)系。針對(duì)STAT3信號(hào)通路絲氨酸激酶MEK1的阻斷劑PD98059能顯著抑制LMP1誘導(dǎo)的VEGF蛋白的表達(dá)和分泌，且隨著PD98059濃度的增加，呈明顯的量效關(guān)系。轉(zhuǎn)染針對(duì)STAT3的siRNA和反義寡核苷酸后，不僅STAT3總蛋白表達(dá)被抑制，STAT3下游靶基因VEGF的表達(dá)和分泌也分別被抑制。我們的實(shí)驗(yàn)證明了LMP1介導(dǎo)的STAT3信號(hào)通路不僅可以上調(diào)VEGF的表達(dá)，而且可以促進(jìn)VEGF分泌到細(xì)胞外發(fā)揮作用。因

14、此我們確定了在LMP1表達(dá)陽性的鼻咽癌細(xì)胞中，存在能性活化中的病理生理學(xué)意義。為進(jìn)一步探討STAT3信號(hào)通路在鼻咽癌細(xì)胞侵襲、轉(zhuǎn)移中的作用機(jī)制。我們利用劃痕實(shí)驗(yàn)，證實(shí)LMP1調(diào)控的STAT3信號(hào)通路被干擾后，鼻咽癌細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)能力減弱，結(jié)合前面的研究結(jié)果提示LMP1可能通過STAT3信號(hào)通路的激活促進(jìn)鼻咽癌細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移。這對(duì)于闡明LMP1作為致瘤蛋白在鼻咽癌侵襲與轉(zhuǎn)移中的分子機(jī)制提供了新的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 結(jié)合上述的研究結(jié)果，我們認(rèn)為