Nedd4對非經(jīng)典炎癥小體的調(diào)控作用研究及其機制的初步探討.pdf

1、膿毒癥是臨床常見的全身性炎癥反應綜合癥，感染、創(chuàng)傷、燒傷、休克等均是其誘因，且死亡率高，是臨床常見的并發(fā)癥之一。研究表明，膿毒癥早期機體會產(chǎn)生過度、過多的促炎因子，雖然促炎反應有利于清除病原菌，但過度的炎癥反應會導致細胞過度焦亡，增加機體的免疫損傷。
　　炎癥小體在炎癥反應中具有重要作用，它是由模式識別受體（pattern recognition receptors，PRRs）檢測病原相關分子模式（pathogen-associa

2、ted molecular patterns，PAMPs）和損傷相關分子模式（damage-associated molecular patterns，DAMPs）后，直接或者通過ASC接頭蛋白同Pro-Caspase-1蛋白形成的復合物，隨即使Caspase-1活化，剪切Pro-IL-1β和Pro-IL-18，并釋放IL-1β和IL-18，這也稱為經(jīng)典炎癥小體。2011年Kayagaki研究發(fā)現(xiàn)Caspase-11是小鼠革蘭氏陰性菌膿

3、毒癥死亡的主要原因，并由此提出了非經(jīng)典炎癥小體。
　　非經(jīng)典炎癥小體以Caspase-11為核心，Caspase-11作為胞內(nèi)模式識別受體識別胞內(nèi)革蘭氏陰性菌細胞壁成分脂多糖（Lipopolysaccharide，LPS），與LPS結(jié)合后發(fā)生寡聚化而活化，繼而使細胞發(fā)生炎性焦亡，以抵御革蘭氏陰性菌感染，但是非經(jīng)典炎癥小體的調(diào)控機制一旦失調(diào)，則可能會引起非經(jīng)典炎癥小體的過度激活，最終導致膿毒癥死亡，所以亟需對非經(jīng)典炎癥小體的調(diào)控機制

4、進行研究。
　　研究發(fā)現(xiàn)，泛素化在經(jīng)典炎癥小體中具有重要的調(diào)控作用，ASC的線性泛素化是NLRP3經(jīng)典炎癥小體激活所必須的，泛素化編輯酶A20亦可通過阻斷NF-κB通路下調(diào)NLRP3、Pro-IL-1β和Pro-IL18的表達，從而負調(diào)控NLRP3經(jīng)典炎癥小體。我們實驗室成員在國外博士后研究期間發(fā)現(xiàn)E3泛素化連接酶Cbl-b通過泛素化修飾NLRP3蛋白負調(diào)控炎癥小體的激活，但是到目前為止關于泛素化對非經(jīng)典炎癥小體的調(diào)控作用仍未見報

5、道。
　　Nedd4是一種重要的HECT型E3泛素連接酶，在多種細胞中表達，且具有多種底物分子，參與著眾多生理過程，研究發(fā)現(xiàn)，Nedd4可通過泛素化Cbl-b促進Th細胞活化，在B細胞中Nedd4可通過對TRAF3 K63形式的泛素化調(diào)節(jié)CD40介導的AKT通路，參與著免疫球蛋白類型的轉(zhuǎn)換。說明Nedd4在獲得性免疫的調(diào)控中具有重要作用，但是在天然免疫中的作用，尤其是對非經(jīng)典炎癥小體的調(diào)控作用及機制需進一步探討，因此本研究將探討

6、Nedd4對非經(jīng)典炎癥小體的調(diào)控作用及機制，為以后干預由革蘭氏陰性菌所引起的膿毒癥提供理論依據(jù)。
　　第一部分:Nedd4對非經(jīng)典炎癥小體調(diào)控作用的研究
　　本部分研究旨在探討Nedd4對非經(jīng)典炎癥小體的調(diào)控作用。首先利用Nedd4+/-小鼠在小鼠水平探討Nedd4對非經(jīng)典炎癥小體的調(diào)控作用。利用低劑量LPS（400ng/kg）腹腔注射Nedd4+/-和野生型小鼠進行引發(fā)（Priming）7小時，然后使用高劑量LPS（10m

7、g/kg）刺激小鼠（activation），建立非經(jīng)典炎癥小體激活模型，觀察小鼠24小時內(nèi)存活率，檢測血清中IL-1β含量，HE染色觀察臟器炎性損傷。
　　隨后在細胞水平探討 Nedd4對非經(jīng)典炎癥小體的調(diào)控作用。利用CRISPR/Cas9技術(shù)建立Nedd4敲除的BMDM細胞系。使用LPS（500ng/ml）引發(fā)Nedd4敲除及其對照細胞4小時，然后按照1×106/ug LPS進行電轉(zhuǎn)，建立非經(jīng)典炎癥小體激活模型，2.5小時后收集

8、細胞培養(yǎng)上清，檢測LDH釋放。此外使用LPS（500ng/ml）引發(fā)Nedd4敲除及其對照細胞7小時，將LPS濃度調(diào)整為2ug/ml同時使用8(16)ug/ml CTB介導LPS進入細胞內(nèi)部，16小時后收集細胞培養(yǎng)上清檢測LDH釋放，對電轉(zhuǎn)實驗結(jié)果進行驗證。
　　結(jié)果表明，相對于野生型小鼠，Nedd4+/-小鼠生存率顯著降低，血清中IL-1β含量顯著升高，心肝具有較嚴重的炎性損傷；細胞實驗結(jié)果顯示，相對于對照組，Nedd4敲除后細

9、胞死亡率顯著升高，且呈現(xiàn)CTB劑量依賴效應。本部分實驗結(jié)果提示，Nedd4對非經(jīng)典炎癥小體具有抑制作用，這為下一步研究調(diào)控的分子機制奠定了基礎。
　　第二部分:Nedd4對非經(jīng)典炎癥小體調(diào)控作用的機制研究
　　本部分研究在第一部分研究結(jié)果的基礎上，以非經(jīng)典炎癥小體的核心分子Caspase-11為切入點，在mRNA水平和蛋白水平初步探討Nedd4調(diào)控非經(jīng)典炎癥小體的分子機制，
　　一、Nedd4對Caspase-11蛋白

10、mRNA水平調(diào)控的研究
　　本章節(jié)探究Nedd4對Caspase-11蛋白mRNA水平調(diào)控作用，通過序列分析，Caspase-11的上游分子p38αVariant2具有Nedd4所特異性識別的結(jié)構(gòu)域，推測p38α可能為Nedd4的底物分子，Nedd4通過調(diào)控p38MAPK通路調(diào)控Caspase-11 mRNA水平。首先利用Real-time PCR的方法探討Nedd4對Caspase-11 mRNA的調(diào)控作用，然后利用LPS刺激N

11、edd4穩(wěn)定敲低（敲除）及其對照細胞，293T細胞共轉(zhuǎn)，MG132和氯喹阻斷等實驗手段，通過ELISA、雙熒光素酶報告系統(tǒng)、Western blot技術(shù)、免疫共沉淀、Ni-NTA純化、質(zhì)譜分析等方法進一步進行研究。
　　與對照組相比，Nedd4穩(wěn)定敲低（敲除）組Caspase-11的mRNA水平顯著升高；TNF-α的分泌顯著增加；p-p38（p38）的蛋白水平顯著升高；雙熒光素酶報告實驗發(fā)現(xiàn)Nedd4抑制轉(zhuǎn)錄因子AP-1活性；p-

12、p38（p38）蛋白經(jīng)泛素化由蛋白酶體和溶酶體途徑進行降解；Co-IP實驗結(jié)果顯示，磷酸化影響Nedd4與p38αV1的相互作用，但對Nedd4與p38αV2的相互作用沒有影響；泛素化實驗結(jié)果表明，Nedd4參與著p38αK48和K63兩種形式的泛素化，磷酸化顯著增強Nedd4對p38αV1/2的K48形式的泛素化；質(zhì)譜分析發(fā)現(xiàn)，p38αV1在K45、K53(K54)和K152位點具有泛素化修飾，p38αV2的K53(K54)、K287

13、和K295位點具有泛素化修飾，K53(K54)位點是共有的泛素化位點。該實驗結(jié)果提示：Nedd4可通過對p38α直接泛素化使其進行降解，起到對p38MAPK通路的負調(diào)控作用，從而實現(xiàn)對Caspase-11 mRNA的負調(diào)控。
　　二、Nedd4對Caspase-11蛋白水平調(diào)控的研究
　　本章主要研究 Nedd4在蛋白水平對 Caspase-11的調(diào)控作用，并初步探討其分子機制。如第一章所述方法，使用LPS刺激、293T細胞

14、共轉(zhuǎn)，mg132和氯喹阻斷等實驗手段，通過Real-time PCR、Western blot技術(shù)、免疫共沉淀、Ni-NTA純化等檢測方法進行探討。
　　與對照組相比，Nedd4穩(wěn)定敲低（敲除）組的Caspase-11蛋白水平顯著升高；Caspase-11蛋白經(jīng)泛素化由蛋白酶體途徑進行降解；Co-IP實驗發(fā)現(xiàn)，Nedd4可與Caspase-11蛋白發(fā)生直接的相互作用；泛素化實驗表明，Nedd4對Caspase-11蛋白具有直接的泛

15、素化作用。該結(jié)果提示Nedd4可通過與Caspase-11蛋白的直接相互作用對其進行泛素化，使其進入蛋白酶體進行降解，說明Nedd4可直接在蛋白水平調(diào)控Caspase-11。
　　綜上所述：本研究通過一系列實驗探討Nedd4對非經(jīng)典炎癥小體的調(diào)控作用，并對其調(diào)控機制進行初步研究。結(jié)果表明，Nedd4對非經(jīng)典炎癥小體具有負調(diào)控作用。Nedd4可通過負調(diào)控p38αMAPK通路實現(xiàn)對非經(jīng)典炎癥小體的核心分子Caspase-11 mRNA