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文檔簡(jiǎn)介
1、目的:棉酚(Gossypol,GOS)是從棉籽中分離提取的黃色多酚羥基雙萘醛類化合物,具有抗真菌、抗炎、抗腫瘤等多種藥理學(xué)活性,但關(guān)于其對(duì)炎癥小體活性影響方面的研究未見報(bào)道。本課題利用細(xì)菌脂多糖(Lipopolysaccharide。LPS)激活的小鼠腹腔巨噬細(xì)胞以及RAW264.7細(xì)胞系,檢測(cè)GOS對(duì)巨噬細(xì)胞中炎癥小體活化的影響,探討GOS激活巨噬細(xì)胞炎癥小體通路的作用機(jī)制,為深入研究GOS對(duì)固有免疫細(xì)胞的藥理和毒理作用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
2、
方法:
1.通過(guò)腹腔注射3%巰基乙酸鹽(Thioglycollate,TG)誘導(dǎo)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞的大量產(chǎn)生。
2.采用碘化丙錠(Propidium iodide,PI)染色法,測(cè)定GOS對(duì)巨噬細(xì)胞的細(xì)胞毒作用。
3.采用蛋白質(zhì)免疫印跡法檢測(cè)GOS對(duì)LPS刺激或未刺激的小鼠腹腔巨噬細(xì)胞和RAW264.7細(xì)胞中炎癥小體通路相關(guān)蛋白質(zhì)表達(dá)水平的影響。
4.采用流式微球捕獲蛋白定量技術(shù)(Cyt
3、ometric beads array,CBA)檢測(cè)GOS對(duì)LPS刺激的小鼠腹腔巨噬細(xì)胞分泌炎癥因子IL-1β的蛋白水平的影響。
5.利用大腸桿菌DH5α活菌腹腔注射,建立小鼠細(xì)菌性敗血癥模型,檢測(cè)GOS對(duì)細(xì)菌性敗血癥小鼠存活率的影響。
結(jié)果:
1. GOS能劑量依賴性和時(shí)間依賴性地引起經(jīng)LPS激活或未刺激的小鼠腹腔巨噬細(xì)胞發(fā)生死亡,且低濃度(<5μM)時(shí)對(duì)細(xì)胞的毒性較低,高濃度(>5μM)時(shí)對(duì)細(xì)胞顯示出較
4、大的毒性。與ATP處理的細(xì)胞相似,GOS引起的細(xì)胞死亡伴隨急劇細(xì)胞膜破裂和HMGB1及pro-caspase11的釋放,提示該死亡是細(xì)胞焦亡。
2.GOS能誘導(dǎo)ASC缺失的RAW264.7細(xì)胞發(fā)生焦亡。
3.GOS能誘導(dǎo)大量HMGB1、pro-IL-1β及pro-caspase-11從LPS刺激的巨噬細(xì)胞釋放到培養(yǎng)液中,但僅能誘導(dǎo)低水平的成熟IL-1β的分泌。
4.泛caspase和caspase-1亞家族
5、抑制劑均能強(qiáng)烈地抑制焦亡的發(fā)生,但caspase-3抑制劑不能。非特異性細(xì)胞保護(hù)劑甘氨酸可以衰減GOS誘導(dǎo)的焦亡,而其他經(jīng)典的焦亡抑制劑(包括氯化鉀和N-乙酰半胱氨酸)可以抑制ATP誘導(dǎo)的焦亡,但對(duì)GOS誘導(dǎo)的焦亡不但沒有抑制反而有增強(qiáng)作用。這些結(jié)果說(shuō)明,GOS可能通過(guò)非經(jīng)典炎癥小體通路誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞焦亡。
5.體內(nèi)實(shí)驗(yàn)顯示,GOS能清除TG引出的腹腔巨噬細(xì)胞,并大量募集其它的免疫細(xì)胞,加重小鼠細(xì)菌性敗血癥,顯著降低細(xì)菌感染模型
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