番茄紅素對(duì)巨噬細(xì)胞炎癥反應(yīng)的調(diào)控及其分子機(jī)制探討.pdf

1、炎癥是臨床常見的一個(gè)病理過程，可以生于機(jī)體各部位的組織和各器官，通常來說，炎癥是機(jī)體的一種抗病反應(yīng)，是對(duì)機(jī)體利于的防御性反應(yīng)，但是過度的炎癥反應(yīng)對(duì)機(jī)體又具有危害性。流行病學(xué)研究提示植物性食品具有廣泛的促進(jìn)健康和防治腫瘤、心血管疾病、糖尿病、肥胖等疾病的作用。其中，植物性食物中存在的大量植物化學(xué)物質(zhì)，它們也具有廣泛的生物活性作用和健康促進(jìn)作用，并逐漸受到人們的關(guān)注。番茄紅素是一種脂溶性的類胡蘿卜素，分子式為C40H56。作為一種天然色素番

2、茄紅素廣泛存在于番茄、西瓜等蔬菜和瓜果中。流行病學(xué)研究資料顯示血漿中番茄紅素的水平與一些慢性疾病如心血管疾病和癌癥的發(fā)生率呈負(fù)相關(guān)。雖然番茄紅素對(duì)一些疾病的防治作用在一定程度上歸功于其強(qiáng)大的抗氧化作用，但近年來的研究證據(jù)顯示番茄紅素也可通過其它的一些作用途徑發(fā)揮機(jī)體保護(hù)效應(yīng)。如最近研究發(fā)現(xiàn)番茄紅素除了具有抗氧化抗癌作用外，還能夠降低血漿膽固醇水平，具有抗增殖和保護(hù)血管內(nèi)皮等功能。炎癥反應(yīng)與一些慢性疾病如動(dòng)脈粥樣硬化，癌癥發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)

3、。番茄紅素對(duì)炎癥反應(yīng)的調(diào)節(jié)作用及其具體的作用靶點(diǎn)和分子作用機(jī)制目前尚不十分清楚，值得深入探討。RAW264.7細(xì)胞是一種鼠源性的巨噬細(xì)胞，可被外界刺激物如LPS激活釋放大量的炎癥因子和炎癥介質(zhì)而模仿體內(nèi)的炎癥反應(yīng)。
　　 目的：通過體外建立LPS誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞炎癥反應(yīng)模型，探討番茄紅素抗炎效應(yīng)及分子作用機(jī)制，并進(jìn)一步明確它對(duì)一些慢性疾病防治的作用機(jī)理。
　　 方法：
　　 ⑴將RAW264.7巨噬細(xì)胞接種于24孔

4、培養(yǎng)板，分別與1μM，5μM，10μM番茄紅素預(yù)孵育1h，再加入1μg/mL LPS孵育24h收集細(xì)胞培養(yǎng)液，分別采用亞硝酸鹽法和ELISA法檢測(cè)巨噬細(xì)胞NO和IL-6生成的水平。
　　 ⑵將RAW264.7巨噬細(xì)胞接種于6孔培養(yǎng)板，分別與1μM，5μM，10μM番茄紅素預(yù)孵育1h，再與1μg/mL LPS孵育6h收集細(xì)胞總RNA用于檢測(cè)iNOS和IL-6的mRNA表達(dá)量；或與1μg/mL LPS孵育24h后收集細(xì)胞總蛋白，采用

5、Western blot方法檢測(cè)iNOS蛋白表達(dá)量。
　　 ⑶用ERK1/2阻斷劑U0126和p38 MAPK阻斷劑SB203580分別預(yù)處理巨噬細(xì)胞2 h，再用1μg/mL LPS刺激細(xì)胞24 h。分別采用亞硝酸鹽法和ELISA法檢測(cè)巨噬細(xì)胞NO和IL-6生成水平。
　　 ⑷RAW264.7巨噬細(xì)胞分別與1μM，5μM，10μM番茄紅素預(yù)孵育1h，再加入1μg/mL LPS刺激細(xì)胞15min，收集、裂解細(xì)胞，運(yùn)用不連續(xù)

6、蔗糖梯度密度超速離心法分離脂筏層和非脂筏層，采用Western blot方法檢測(cè)脂筏層和非脂筏層TLR4蛋白的表達(dá)。
　　 ⑸將TLR4 siRNA轉(zhuǎn)染巨噬細(xì)胞24h后，再加入LPS1μg/mL刺激細(xì)胞不同的時(shí)間，分別采用亞硝酸鹽法、ELISA法和Western blot方法檢測(cè)NO和IL-6合成釋放水平，NF-κB DNA結(jié)合活性以及ERK/p38磷酸化水平。
　　 結(jié)果：
　　 ①1μM，5μM，10μM番茄

7、紅素孵育RAW264.7巨噬細(xì)胞24h，測(cè)定細(xì)胞培養(yǎng)液中LDH含量和檢測(cè)MTT吸光度值。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，各種不同濃度的番茄紅素對(duì)細(xì)胞LDH釋放量和增殖無明顯的影響，表明1-10μM番茄紅素對(duì)RAW264.7巨噬細(xì)胞無毒性作用。
　　 ②1μg/mL LPS作用RAW264.7巨噬細(xì)胞24h，細(xì)胞NO合成釋放量顯著增加，約為空白對(duì)照組的7倍(p＜0.001)。5μM，10μM番茄紅素能夠明顯抑制LPS誘導(dǎo)的NO合成釋放，NO分泌量較LP

8、S對(duì)照組相比分別降低了27.9％和52.8％，差距具有顯著性(P＜0.01，p＜0.001)。
　　 ③1μg/mL LPS作用RAW264.7巨噬細(xì)胞24h，細(xì)胞IL-6分泌量約為空白對(duì)照組的6倍(p＜0.001)。1μM，5μM，10μM番茄紅素能夠抑制LPS誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞IL-6分泌，且隨著番茄紅素濃度增加，抑制作用增強(qiáng)，存在著明顯的劑量-效應(yīng)關(guān)系(P＜0.05，P＜0.001，p＜0.001)。
　　 ④1μg/m

9、L LPS可明顯誘導(dǎo)I-κBα磷酸化，降解，促進(jìn)NF-κB核轉(zhuǎn)移和增加NF-κB DNA結(jié)合活性，差距均具有顯著性(p＜0.001或P＜0.01)。1μM番茄紅素對(duì)NF-κB激活無明顯的影響，5μM和10μM番茄紅素預(yù)孵育細(xì)胞可明顯阻斷LPS誘導(dǎo)的I-κBα降解、NF-κB活化和核內(nèi)轉(zhuǎn)移(p＜0.001，P＜0.01或P＜0.01，p＜0.001)。說明番茄紅素可通過抑制LPS誘導(dǎo)NF-κB激活而降低RAW264.7巨噬細(xì)胞NO和IL-

10、6分泌。
　　 ⑤1μg/mL LPS刺激RAW264.7巨噬細(xì)胞30min后，可顯著誘導(dǎo)ERK1/2，p38MAPK和JNK磷酸化，與對(duì)照組比較，差距具有顯著性(p＜0.001)。1μM，5μM，10μM番茄紅素能夠抑制LPS誘導(dǎo)ERK1/2，p38 MAPK磷酸化，而對(duì)JNK的活化無明顯的影響，其中以5μM，10μM番茄紅素作用最強(qiáng)(P＜0.01p＜0.001，P＜0.001 p＜0.001)。為了進(jìn)一步明確干擾ERK/p3

11、8通路激活介導(dǎo)了番茄紅素的抗炎效應(yīng)，分別用ERK1/2阻斷劑U0126和p38 MAPK阻斷劑SB203580預(yù)處理巨噬細(xì)胞2 h，發(fā)現(xiàn)分別阻斷ERK1/2和p38 MAPK后，LPS誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞NO和IL-6分泌明顯降低，與LPS組比較，差距具有顯著性(p＜0.001p＜0.001，P＜0.01 p＜0.001)。說明ERK1/2和p38 MAPK通路激活在LPS誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞NO和IL-6生成中起著重要的作用，番茄紅素可通過阻斷L

12、PS誘導(dǎo)ERK/p38通路激活，進(jìn)而抑制NF-κB依賴的NO和IL-6分泌。
　　 ⑥運(yùn)用不連續(xù)的蔗糖密度梯度超速離心分離細(xì)胞脂筏和非脂筏層，檢測(cè)TLR4受體在脂筏和非脂筏層分布發(fā)現(xiàn)，LPS處理細(xì)胞15min較正常細(xì)胞相比，脂筏層TLR4分布明顯增加，LPS可明顯募集TLR4轉(zhuǎn)位到脂筏處分布。番茄紅素能夠抑制LPS誘導(dǎo)的TLR4易位到脂筏，與LPS刺激組比較，脂筏層TLR4分布減少。
　　 ⑦為了進(jìn)一步證實(shí)TLR4受體在

13、LPS誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞炎癥反應(yīng)中的作用。TLR4 siRNA轉(zhuǎn)染巨噬細(xì)胞24后，LPS刺激細(xì)胞不同的時(shí)間，分別檢測(cè)NO和IL-6分泌，NF-κB DNA結(jié)合活性以及ERK/p38磷酸化水平。結(jié)果顯示，TLR4siRNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞組，LPS刺激的NO和IL-6分泌(p＜0.001，p＜0.001)，NF-κBDNA結(jié)合活性(p＜0.001)以及ERK/p38磷酸化水平(p＜0.001，p＜0.001)均顯著低于正常細(xì)胞刺激組，而與未刺激的空白

14、對(duì)照組無明顯差別，表明抑制TLR4通路將阻斷LPS誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)，TLR4在LPS誘導(dǎo)的炎癥發(fā)生中起著重要的銜接傳導(dǎo)作用。同時(shí)也說明番茄紅素可通過干預(yù)炎癥信號(hào)傳遞通路中的上游調(diào)控受體TLR4脂筏易位，從而阻斷LPS誘導(dǎo)的下游炎癥信號(hào)通路的傳遞和炎癥反應(yīng)發(fā)生。
　　 結(jié)論：
　　 ⑴番茄紅素能夠抑制LPS誘導(dǎo)的RAW264.7巨噬細(xì)胞中iNOS和IL-6的表達(dá)，降低iNOS和IL-6的表達(dá)產(chǎn)物NO和IL-6的生成，抑制LP

15、S誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞炎癥反應(yīng)。
　　 ⑵番茄紅素能夠抑制LPS誘導(dǎo)的NF-κB和ERK/p38激酶的激活，阻斷ERK/p38激酶的激活可減少LPS誘導(dǎo)的NO和IL-6合成分泌，表明番茄紅素可通過阻斷ERK/p38激酶的激活，進(jìn)而抑制NF-κB依賴的炎癥分子NO和IL-6生成。
　　 ⑶番茄紅素能夠抑制LPS誘導(dǎo)的TLR4受體的脂筏易位，沉默TLR4基因表達(dá)可阻斷LPS誘導(dǎo)的NF-κB和ERK/p38激酶的激活，NO和IL-6