FoxO3a通過直接下調(diào)EPS8抑制非小細(xì)胞肺癌生長的作用機(jī)制.pdf

1、表皮生長因子受體酪氨酸激酶抑制劑(Epidermal growth factor receptor tyrosine kinase inhibitors, EGFR-TKIs)的治療能顯著延長存在EGFR突變的非小細(xì)胞肺癌(Non-small cell lung cancer, NSCLC)患者的存活時(shí)間。吉非替尼(Gefitinib)是全球最早進(jìn)入臨床的EGFR-TKIs，2003年被FDA批準(zhǔn)作為NSCLC的三線治療藥物，2005年

2、獲中國食品藥品監(jiān)督管理局批準(zhǔn)用于治療既往接受過化療的局部晚期或轉(zhuǎn)移性NSCLC患者，然而，部分患者對Gefitinib原發(fā)耐藥。
　　FoxO3a作為叉頭蛋白家族的轉(zhuǎn)錄因子可以參與細(xì)胞中的多種生理生化活動進(jìn)程，但其在原發(fā)性EGFR-TKIs耐藥及調(diào)控腫瘤增殖方面的機(jī)制尚不明確。生長因子調(diào)控包括增殖，分化和代謝等在內(nèi)的一系列細(xì)胞生命進(jìn)程。通過與配體結(jié)合，生長因子受體酪氨酸激酶(receptor tyrosine kinases，RT

3、K)的內(nèi)在催化活性激活。通過自身磷酸化并磷酸化細(xì)胞內(nèi)底物使生長信號傳遞到胞內(nèi)。因此，識別和鑒定被RTKs酪氨酰磷酸化的蛋白質(zhì)是闡明RTKs介導(dǎo)的信號通路的關(guān)鍵。在這里，我們研究表皮生長因子受體通路底物8(EGFR pathway substrate8，EPS8)并探究其與FoxO3a的相互作用關(guān)系，討論其生物學(xué)功能以及對NSCLC耐藥，增殖和轉(zhuǎn)移的影響，為臨床解決 Gefitinib耐藥問題提供新的治療策略，并為此提供實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)支持。

4、r>　　目的：
　　通過動物模型和細(xì)胞模型，使用基因沉默和過表達(dá)等分子生物學(xué)方法，系統(tǒng)研究FoxO3a和EPS8對NSCLC細(xì)胞耐藥，增殖及轉(zhuǎn)移的影響。闡明二者在抑制EGFR-TKIs原發(fā)耐藥中的地位，并探討EPS8作為抗癌治療新靶標(biāo)在臨床治療中所發(fā)揮的重要作用。
　　方法：
　　1. FoxO3a在NSCLC患者中的表達(dá)
　　熒光原位雜交(FISH)檢測75例NSCLC患者EGFR的突變類型。同時(shí)，對該75例患

5、者的組織芯片進(jìn)行免疫組化染色，檢測FoxO3a的表達(dá)程度。
　　2. FoxO3a對PC9細(xì)胞耐藥性的影響
　　為了體外驗(yàn)證FoxO3a對EGFR-TKIs耐藥性的影響，我們通過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將FoxO3a過表達(dá)和沉默，通過MTT法檢測NSCLC細(xì)胞株對Gefitinib的敏感性，繪制抑制曲線并計(jì)算IC50。
　　3.體外探究FoxO3a與EPS8的關(guān)系
　　為了研究FoxO3a的調(diào)控機(jī)制，我們采用Western

6、Blot檢測與腫瘤耐藥、周期、凋亡及轉(zhuǎn)移等活動密切相關(guān)的蛋白EPS8，CD31, CD44, CyclinD1以及Bcl-2的改變情況。同時(shí)為了驗(yàn)證FoxO3a和EPS8之間的關(guān)系，我們通過RT-PCR檢測FoxO3a過表達(dá)后EPS8的mRNA含量變化。
　　4. EPS8對PC9細(xì)胞耐藥性的影響
　　我們通過Western blot檢測PC9和A549細(xì)胞中FoxO3a和EPS8的蛋白表達(dá)情況，并通過MTT法對EPS8過表

7、達(dá)和沉默后的PC9細(xì)胞株的Gefitinib敏感性進(jìn)行檢測。
　　5. FoxO3a和EPS8對PC9細(xì)胞遷移侵襲的影響
　　脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染將FoxO3a和EPS8分別過表達(dá)和沉默后，通過Transwell細(xì)胞遷移侵襲模型檢測兩種基因改變前后PC9細(xì)胞的遷移和侵襲能力改變。
　　6. FoxO3a和EPS8對PC9細(xì)胞凋亡及周期的影響
　　將FoxO3a和EPS8分別過表達(dá)和沉默后，采用Annexin V-7AAD/

8、PE兩種熒光染料雙染(細(xì)胞凋亡)或PI單染(細(xì)胞周期)，流式細(xì)胞儀488 nm波長處檢測兩種基因改變前后對PC9細(xì)胞早期和晚期凋亡的改變。
　　7. FoxO3a和EPS8對BALB/c裸鼠腫瘤生長的影響
　　為了研究 FoxO3a及 EPS8在體內(nèi)環(huán)境中對腫瘤增殖的影響，我們分別將FoxO3a和 EPS8過表達(dá)和沉默后，調(diào)整細(xì)胞濃度為2×107個(gè)/ml，于六周齡BALB/c裸鼠右側(cè)腋窩皮下注射，每只注射0.1 ml，每組6

9、只。從注射第6天起，每隔三天用游標(biāo)卡尺測量裸鼠腫瘤的長徑和短徑，活體裸鼠腫瘤體積計(jì)算公式=1/2(短徑2×長徑)。21天后處死裸鼠，剝離腫瘤稱重。
　　8.臨床驗(yàn)證FoxO3a和EPS8的相關(guān)性
　　我們分別通過體外實(shí)驗(yàn)和動物實(shí)驗(yàn)探究FoxO3a和EPS8兩者的生物學(xué)功能及可能存在的相互作用關(guān)系后，再次對75例NSCLC患者的空白組織芯片進(jìn)行EPS8蛋白免疫組化染色，探究臨床上EPS8和FoxO3a表達(dá)的相關(guān)性及二者在癌與癌

10、旁中的表達(dá)差異。
　　9.體外探究FoxO3a對EPS8的調(diào)控作用
　　我們?yōu)樯钊胩骄哭D(zhuǎn)錄因子FoxO3a調(diào)控EPS8的具體作用機(jī)制，首先在NCBI網(wǎng)站查詢出EPS8基因2000 bp長度的啟動子區(qū)，然后通過http://jaspar.genereg.net/網(wǎng)站預(yù)測 FoxO3a在 EPS8啟動子區(qū)上可能存在的結(jié)合位點(diǎn)。隨后設(shè)計(jì)相應(yīng)RT-PCR引物，使擴(kuò)增產(chǎn)物包含預(yù)測的結(jié)合序列。
　　通過雙熒光素酶報(bào)告基因和染色質(zhì)免

11、疫共沉淀方法檢測FoxO3a是否通過直接結(jié)合EPS8的核心啟動子區(qū)而發(fā)揮轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用。
　　結(jié)果：
　　1. FoxO3a的高表達(dá)與EGFR-TKIs敏感性有關(guān)
　　NSCLC患者中 FoxO3a的細(xì)胞核染色強(qiáng)度較細(xì)胞質(zhì)染色更強(qiáng)。EGFR-TKIs未突變組(n=42)的 FoxO3a高表達(dá)比例為12％，而 EGFR-TKIs突變組(n=33)中FoxO3a高表達(dá)比例為36%，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.001)。

12、>　　作為ATP競爭性酪氨酸激酶抑制劑克唑替尼的作用靶點(diǎn)，ALK陽性突變與EGFR-TKIs耐藥并無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.138)。
　　2. FoxO3a增加PC9細(xì)胞對Gefitinib的敏感性
　　與對照組(IC50=68.04±3.25 nM)相比，F(xiàn)oxO3a過表達(dá)增強(qiáng)了Gefitinib對PC9細(xì)胞的生長抑制(IC50=22.69±1.33 nM)，P＜0.05。FoxO3a沉默減弱了Gefitinib對PC9細(xì)胞

13、的生長抑制(IC50=286.14±11.03 nM)，P＜0.01。
　　3. FoxO3a負(fù)性調(diào)控EPS8的表達(dá)
　　我們通過Western blot檢測FoxO3a分別過表達(dá)和沉默后，檢測與腫瘤發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)的CD31、CD44、CyclinD1和Bcl-2以及EPS8的蛋白含量變化。結(jié)果顯示，F(xiàn)oxO3a過表達(dá)后 EPS8的蛋白表達(dá)下降(P＜0.05)；FoxO3a沉默后EPS8的蛋白表達(dá)顯著升高(P＜0.01)。

14、通過轉(zhuǎn)染高表達(dá)FoxO3a的質(zhì)粒，RT-PCR檢測發(fā)現(xiàn)FoxO3a mRNA的過表達(dá)顯著抑制了EPS8 mRNA的表達(dá)(P＜0.05)，
　　4. EPS8降低NSCLC細(xì)胞對Gefitinib的敏感性
　　Western blot檢測發(fā)現(xiàn)，A549細(xì)胞中FoxO3a的相對蛋白含量低于PC9細(xì)胞(P＜0.05)；而與PC9細(xì)胞相比，EPS8在A549細(xì)胞中蛋白表達(dá)更高(P＜0.05)。MTT檢測發(fā)現(xiàn)，與對照組相比(IC50=

15、68.04±3.25 nM)，EPS8的過表達(dá)顯著抑制了PC9細(xì)胞對Gefitinib的敏感性(IC50=387.33±20.74 nM)，P＜0.05；EPS8沉默后顯著提高了PC9細(xì)胞對Gefitinib的敏感性(IC50=15.93±2.60 nM)，P＜0.05。
　　5.過表達(dá)和沉默F(xiàn)oxO3a及EPS8對PC9細(xì)胞遷移侵襲的影響
　　Transwell遷移實(shí)驗(yàn)中，與對照組264±12個(gè)遷移細(xì)胞數(shù)相比，EPS8過表

16、達(dá)后遷移細(xì)胞數(shù)增加到391±23個(gè)；FoxO3a過表達(dá)后遷移細(xì)胞數(shù)減少到123±8個(gè)(P＜0.05)。EPS8沉默后遷移細(xì)胞數(shù)減少到69個(gè)；FoxO3a沉默后遷移細(xì)胞數(shù)增加到213個(gè)(P＜0.01)。
　　Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)中，與對照組111±9個(gè)細(xì)胞數(shù)相比，EPS8過表達(dá)后遷移細(xì)胞數(shù)增加到220±36個(gè)；FoxO3a過表達(dá)后侵襲細(xì)胞數(shù)減少到79±4個(gè)(P＜0.05)。EPS8沉默后遷移細(xì)胞數(shù)減少到57±6個(gè)；FoxO3a

17、沉默后遷移細(xì)胞數(shù)增加到152±14個(gè)(P＜0.01)。
　　6.過表達(dá)和沉默F(xiàn)oxO3a及EPS8對PC9細(xì)胞凋亡、周期的影響
　　經(jīng)流式細(xì)胞凋亡檢測發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)oxO3a過表達(dá)和EPS8沉默后，PC9細(xì)胞的早、晚期凋亡比例從原來的8.59%分別上升到12%和22.6%；FoxO3a沉默和 EPS8過表達(dá)時(shí)，PC9細(xì)胞的早、晚期凋亡比例較原來的8.59%分別下降至6.05%和4.92%。
　　經(jīng)流式細(xì)胞周期檢測發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)ox

18、O3a過表達(dá)和EPS8沉默后，PC9細(xì)胞的增殖指數(shù)PI從原來的47.31%分別下降到24.76%和37.56%；FoxO3a沉默和EPS8過表達(dá)時(shí)，PC9細(xì)胞的PI較原來的47.31%分別上升至56.4%和57.71%。
　　7.過表達(dá)和沉默F(xiàn)oxO3a及EPS8對BALB/c裸鼠腫瘤生長的影響
　　經(jīng)皮下注射FoxO3a及EPS8分別高表達(dá)和沉默的PC9細(xì)胞，飼養(yǎng)21天后，檢測腫瘤體積。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與對照組(380±25mm

19、3)相比，si-FoxO3a組和 EPS8組荷瘤裸鼠腫瘤體積顯著增加(541±62 mm3, P＜0.05;826±82 mm3, P＜0.01)；FoxO3a組和si-EPS8組荷瘤裸鼠腫瘤體積顯著降低(216±18mm3, P＜0.05;249±35mm3, P＜0.01)。
　　剝離荷瘤稱重發(fā)現(xiàn)，與對照組(0.28±0.04g)相比，si-FoxO3a組和EPS8組荷瘤裸鼠腫瘤體積顯著增加(0.37±0.06g, P＜0.0

20、1;0.58±0.11g, P＜0.01)；FoxO3a組和si-EPS8組荷瘤裸鼠腫瘤體積顯著降低(0.10±0.02g, P＜0.01;0.18±0.03g, P＜0.01)。
　　8.臨床驗(yàn)證FoxO3a和EPS8的負(fù)相關(guān)關(guān)系
　　免疫組化染色發(fā)現(xiàn)，EPS8主要為胞漿表達(dá)。在33例EGFR-TKIs突變患者中EPS8高表達(dá)患者有8例，占比24%；42例EGFR-TKIs未突變患者中EPS8高表達(dá)患者有24例，占比57%

21、(P＜0.001)。在58例FoxO3a低表達(dá)患者中發(fā)現(xiàn)EPS8高表達(dá)者為27例(47%)，在17例FoxO3a高表達(dá)患者中EPS8高表達(dá)患者為5例(29%)，P＜0.01。
　　我們通過對每例患者癌與癌旁的FoxO3a和EPS8表達(dá)情況進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)患者癌組織/癌旁組織中FoxO3a的H-score評分分別為32/88；EPS8的H-score評分分別為104/69，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.0001)。
　　9. F

22、oxO3a直接調(diào)控EPS8的表達(dá)
　　通過雙熒光素酶報(bào)告基因發(fā)現(xiàn)EPS8啟動子區(qū)-837~-382片段是其核心區(qū)域。隨后在染色質(zhì)免疫共沉淀技術(shù)(ChIP)中，我們在這段核心區(qū)中的預(yù)測結(jié)合位點(diǎn)附近設(shè)計(jì)EPS8擴(kuò)增引物。ChIP發(fā)現(xiàn)EPS8引物組中FoxO3a/IgG的富集倍數(shù)為8.9倍，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果說明，轉(zhuǎn)錄因子FoxO3a直接結(jié)合EPS8核心啟動子區(qū)中的CAGTTTAC序列而發(fā)揮對后者的轉(zhuǎn)錄負(fù)調(diào)控作用。
　　結(jié)論

23、：
　　1. FoxO3a在EGFR突變的NSCLC患者中高表達(dá)；EPS8在EGFR突變的NSCLC患者中低表達(dá)，且與FoxO3a的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)。
　　2. FoxO3a在癌組織中的表達(dá)低于癌旁組織；EPS8在癌組織中的表達(dá)高于癌旁組織。
　　3. FoxO3a增強(qiáng)了PC9細(xì)胞對Gefitinib的敏感性；EPS8降低了PC9細(xì)胞對Gefitinib的敏感性。
　　4. FoxO3a能夠抑制PC9細(xì)胞的遷移和侵襲