2023年全國碩士研究生考試考研英語一試題真題(含答案詳解+作文范文)_第1頁
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文檔簡介

1、目的:
  1.體外實驗探討熊果酸(ursolic acid,UA)對人肝癌HepG2、Bel-7402細胞生長抑制的分子作用機制。
  2.動物實驗探討熊果酸對人肝癌HepG2裸鼠移植瘤生長和對肝癌裸鼠移植瘤相關蛋白表達的影響,初步了解熊果酸體內抗肝癌機制。
  方法:
  1.采用四甲基偶氮甲唑鹽比色(MTT)方法檢測UA對Bel-7402肝癌細胞的24h,48 h和72 h的細胞生存率作用。同時觀察UA對多

2、種肝癌絀胞的抑制作用。采用流式細胞術(Flow Cytometry,F(xiàn)CM)檢測UA對Bel-7402和HepG2肝癌細胞24h周期的影響;蛋白質免疫印跡(Western blot,WB)法檢測UA對Bel-7402和HepG2肝癌細胞p38MAPK磷酸化蛋白的表達;劑量依賴性的檢測UA作用于Bel-7402和HepG2肝癌細胞24h FOXO3a、IGFBP1蛋白表達情況;然后通過實時熒光定量PCR(qRT-PCR)法檢測IGFBP1

3、 mRNA表達水平;雙熒光素酶報告基因法檢測UA對Bel-7402和HepG2肝癌細胞IGFBP1啟動子活性;采用p38MAPK抑制劑SB203580,進一步研究UA通過p38MAPK對FOXO3a、IGFBP1蛋白表達的影響以及對IGFBP1啟動子活性的作用。采用沉默(RNA干擾)和過表達技術進行細胞瞬時轉染的方法,研究UA對肝癌的細胞生長抑制作用以及對FOXO3a、IGFBP1蛋白表達的影響;
  2.體內藥效研究,帶熒光素酶

4、的HepG2細胞造肝癌裸鼠腋下移植瘤模型,成瘤后,根據(jù)裸鼠體重與腫瘤體積的大小,進行隨機化分組,然后將其分為三組:空白對照組;熊果酸低劑量組(25 mg.kg-1.d-1,腹腔注射,連續(xù)用藥30天);熊果酸高劑量組(50 mg.kg-1.d-1,腹腔注射,連續(xù)用藥30天)。用小動物活體成像技術觀察給予熊果酸低劑量和高劑量處理后移植瘤體重熒光素酶標記的HepG2細胞增殖情況:到達作用時間后,測量腫瘤體積、腫瘤大小和稱量裸鼠、腫瘤的重量。提

5、取腫瘤組織蛋白后,采用Western bolt法觀察高劑量熊果酸處理后裸鼠移植瘤組織p-p38MAPK、FOXO3a和IGFBP1蛋白表達的變化。
  結果:
  體外實驗:
  1.MTT法結果表明,熊果酸對肝癌細胞Bel-7402具有顯著性的抑制作用,呈劑量依賴性,和對照組比較,濃度在15~30μM時,差異具有統(tǒng)計學意義(p<0.05)。24h熊果酸的IG0=23.04±0.68μM,48 h的IC50=22.84

6、5±0.875μM,72 h的IC50=21.525±1.245μM。熊果酸對多種肝癌細胞包括HepG2、Bel-7402、QJY-7703、MHCC97L和MHCC97H,在一定的時間和劑量下具有不同的抑制效果,和對照組比較差異具有統(tǒng)計學意義(p<0.05)。細胞瞬時轉染方法結果顯示,沉默F(xiàn)OXO3a可以逆轉熊果酸對Bel-7402、HepG2肝癌細胞的生長抑制作用。沉默IGFBP1可以逆轉熊果酸對Bel-7402、 HepG2肝癌細

7、胞的生長抑制作用。先沉默IGFBP1,然后再過表達IGFBP1,可以修復熊果酸對Bel-7402、HepG2肝癌細胞的生長抑制作用,加藥組和未轉染加藥組之間,差異具有統(tǒng)計學意義(p<0.05)。
  2.流式細胞術結果發(fā)現(xiàn)熊果酸可誘導Bel-7402、HepG2肝癌細胞發(fā)生G0/G1期阻滯。在Bel-7402細胞中,G0/G1期細胞比例在20μM、25μM處理時上升,20~25μM UA在G0/G1期百分率分別為73.968±2.

8、24和77.81±2.49。在HepG2細胞中,G0/G1期細胞比例在5μM、20μM和25μM處理時上升,5~25μM UA在G0/G1期百分率分別為60.19±0.42、74.89±1.32和75.06±1.32,與對照組比較具有統(tǒng)計學意義(p<0.05)。
  3.Westernblot法檢測蛋白表達結果顯示熊果酸可以時間依賴性的增加p38MAPK的磷酸化。對于Bel-7402和HepG2肝癌細胞,熊果酸24 h可以劑量依賴

9、性的增加IGFBP1、FOXO3a蛋白的表達,和對照組比較,差異具有統(tǒng)計學意義(p<0.05)。
  4.qRT-PCR法檢測在Bel-7402、HepG2肝癌細胞中,熊果酸可以增加IGFBP1 mRNA的基因表達量,和對照組比較,差異具有統(tǒng)計學意義(p<0.05)。
  5.雙熒光素酶報告基因法檢測在Bel-7402、HepG2肝癌細胞中,熊果酸可以增強IGFBP1啟動子的活性,和對照組比較,差異具有統(tǒng)計學意義(p<0.0

10、5)。
  6.Western blot法和雙熒光素酶報告基因法結果顯示給予p38MAPK抑制劑干預可以阻斷熊果酸導致Bel-7402和HepG2肝癌細胞中IGFBP1、FOXO3a的上調以及IGFBP1啟動子活性的增加。熊果酸單獨給藥組和熊果酸聯(lián)合抑制劑組相比,差異具有統(tǒng)計學意義(p<0.05)。在肝癌Bel-7402、HepG2細胞中,沉默IGFBP1基因可以逆轉熊果酸對FOX03a的上調影響,而沉默F(xiàn)OXO3a基因,并不能逆

11、轉熊果酸對IGFBP1的上調影響。
  7.細胞瞬時轉染法和Western blot法結果表明在Bel-7402、HepG2肝癌細胞中,過表達IGFBP1基因可以增強熊果酸對p-p38MAPK、FOXO3a的上調影響,過表達FOXO3a基因可以增強熊果酸對p-p38MAPK的上調影響,給藥組和未轉染給藥組相比,差異具有統(tǒng)計學意義(p<0.05),但對IGFBP1的作用無明顯影響。
  體內實驗:
  1.動物實驗結果表

12、明,與對照組相比,高劑量熊果酸組能使HepG2移植瘤裸鼠的瘤體和瘤重變小,差異具有統(tǒng)計學意義(p<0.05)。對裸鼠重量無明顯變化,因此,熊果酸在體內亦能抑制HepG2肝癌細胞的生長。
  2.在HepG2移植瘤裸鼠腫瘤組織中,高劑量熊果酸可以增強p-p38MAPK、FOXO3a和IGFBP1蛋白的表達,和對照組相比,差異具有統(tǒng)計學意義(p<0.05)。
  結論:
  1.體外實驗表明,熊果酸可以通過活化p38MAP

13、K激酶途徑,從而增加Bel-7402、HepG2肝癌細胞中IGFBP1和轉錄因子FOXO3a蛋白的表達,并且可以使Bel-7402、HepG2細胞停滯于G0/G1期。同時,增加p38MAPK磷酸化可以增強IGFBP1和FOXO3a蛋白的表達。過表達IGFBP1和FOXO3a可以反饋協(xié)同熊果酸對p38MAPK的刺激作用,此反饋調節(jié)環(huán)路進一步提示IGFBP1和FOXO3a的表達在介導熊果酸抑制肝癌細胞生長機制中的重要作用;
  2.通

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