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文檔簡介
1、目的:
原發(fā)性肝癌是嚴重威脅我國人民健康的惡性腫瘤之一,目前我國肝癌患者死亡率居高不下。根據(jù)現(xiàn)有認識,慢性肝損害刺激肝細胞過度增殖是肝細胞肝癌發(fā)生的主要病理機制之一。熱休克蛋白(heat shock Protein,HSP)又稱應激蛋白,廣泛存在于原核、真核細胞中,進化上高度保守。在HSP家族中,HSP70亞族在細胞內(nèi)的含量最多,免疫原性最強,因此成為研究的重點。我們認為HSP70作用的多樣性,除了與受到的應激刺激多樣和分布的
2、細胞種類有關(guān)外,主要與HSP70在組織中的分布位置有關(guān)。根據(jù)HSP70在組織中的不同分布,可以將其分為細胞內(nèi)HSP70和細胞外HSP70。在某些病理狀態(tài)下,如腫瘤進展或炎癥反應中,細胞內(nèi)HSP70及HSP70肽復合物(HSP70-Peptide Complexes,HSP70-PCs)可以通過分泌、胞吐和細胞破裂、壞死而被釋放到細胞外。釋放到細胞外的HSP70/HSP70-PCs能調(diào)控腫瘤的多種生物學行為,包括增殖,侵襲等。但是,細胞外
3、HSP70/HSP70-PCs是跨膜轉(zhuǎn)導的機制目前尚不清楚。Toll樣受體(TLRs)是一類天然免疫受體家族,在機體的固有免疫反應中起重要作用。TLRs能夠識別不同外源性刺激并將信號進一步進行轉(zhuǎn)導。在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中,腫瘤細胞釋放大量物質(zhì),包括HSP70、TNF-α等?,F(xiàn)已發(fā)現(xiàn)包括肝癌細胞在內(nèi)的多種腫瘤細胞表面均有TLRs的表達。那么在肝癌細胞中,細胞外HSP70/HSP70-PCs是否通過TLRs介導的跨膜作用發(fā)揮其功能?細胞外H
4、SP70/HSP70-PCs又是通過哪些轉(zhuǎn)導通路實現(xiàn)細信號的細胞內(nèi)轉(zhuǎn)導,進而活化轉(zhuǎn)錄因子調(diào)節(jié)腫瘤細胞的增殖?本研究我們首先檢測肝癌組織中TLRs的表達情況,然后研究細胞外HSP70/HSP70-PCs刺激前后肝癌細胞增殖的改變,探討TLRs信號轉(zhuǎn)導活化途徑。
方法:
1、應用MTT對比細胞外HSP70/HSP70-PCs刺激前后肝癌細胞株增殖的改變。然后阻斷TLR2與TLR4檢測細胞外HSP70/HSP70-PCs對
5、肝癌細胞增殖的影響。
2、應用western blot與real-time RT-PCR檢測細胞外HSP70/HSP70-PCs對TLR2、TLR4表達的影響;應用免疫共沉淀、GST Pull Down與放線菌酮檢測HSP70與TLR2、TLR4之間的關(guān)系。
3、利用western blot檢測和對比HSP70/HSP70-PCs刺激前后肝癌細胞JNK1/2、Cyclin D1蛋白的表達情況。然后檢測阻斷JNK1/2
6、后HSP70/HSP70-PCs刺激肝癌細胞株Cyclin D1蛋白的表達情況。
結(jié)果:
1、細胞外HSP70/HSP70-PCs刺激肝癌細胞HepG2后明顯促進肝癌細胞增殖,而同時阻斷TLR2與TLR4能抑制細胞外HSP70/HSP70-PCs對肝癌細胞的促增殖作用。
2、細胞外HSP70/HSP70-PCs刺激肝癌細胞HepG2后TLR2、TLR4蛋白mRNA與蛋白明顯增加;細胞外HSP70/HSP70
7、-PCs能夠與TLR2、TLR4形成復合物并上調(diào)其穩(wěn)定性發(fā)揮其作用。
3、細胞外HSP70/HSP70-PCs刺激肝癌細胞HepG2后p-JNK1/2、Cyclin D1表達明顯增加,阻斷JNK1/2后Cyclin D1表達明顯降低。
結(jié)論:
1、細胞外HSP70/HSP70-PCs促進肝癌細胞增殖是通過與TLR2、TLR4形成復合物并上調(diào)其穩(wěn)定性發(fā)揮作用。
2、細胞外HSP70/HSP70-PC
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