TLR4受體信號(hào)傳導(dǎo)通路參與人肝癌細(xì)胞株HepG-2分泌細(xì)胞因子機(jī)制的研究.pdf

1、本文首先研究肝癌細(xì)胞株HepG-2表面TLR4表達(dá)的情況，然后研究LPS刺激前后細(xì)胞因子分泌的改變情況，探討TLR4的信號(hào)傳導(dǎo)活化途徑，最后研究TLR4內(nèi)源性配體HSP70的作用途徑。 研究方法： 1．分別利用RT-RCR和Western-blot方法檢測(cè)肝癌細(xì)胞株HepG-2細(xì)胞TL-R4mRNA和TLR4蛋白的表達(dá)情況。 2．利用免疫組化的方法觀察TLR4受體在肝癌組織中的表達(dá)情況。 3．利用R17-

2、PCR和Western-blot方法分別檢測(cè)和對(duì)比LPS刺激前后肝癌細(xì)胞株HepG-2中TGF-β1，VEGF,IL-6 mRNA和蛋白的表達(dá)情況。然后檢測(cè)阻斷TLR4受體后LPS刺激肝癌細(xì)胞株HepG-2后TGF-β1，VEGF,IL-6 mRNA和蛋白的表達(dá)情況。 4．利用RT-PCR和Western-blot方法分別檢和對(duì)比LPS刺激前后肝癌細(xì)胞株HepG-2中NF-kB mRNA和蛋白的表達(dá)情況。然后檢測(cè)阻斷TLR4受體

3、后LPS刺激肝癌細(xì)胞株HepG-2后NF-kB mRNA和蛋白的表達(dá)情況。 5．HSP70-腫瘤肽復(fù)合物的純化：肝癌組織應(yīng)用裂解液進(jìn)行勻漿，并高速離心制備總蛋白。上述的總蛋白依次進(jìn)行ConA-Sepharose親和層析和DEAE-Sephacel離子交換層析分離純化。所得蛋白經(jīng)SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳和Westem blot進(jìn)行蛋白分子量及性質(zhì)鑒定，Bradford法測(cè)定蛋白濃度。 6．利用RT-PCR和Westem-

4、blot方法分別檢測(cè)和對(duì)比HSP70-腫瘤肽復(fù)合物刺激前后肝癌細(xì)胞株HepG-2中TGF-β1，VEGF,IL-6 mRNA和蛋白的表達(dá)情況。然后檢測(cè)阻斷TLR4受體后HSP70-腫瘤肽復(fù)合物刺激肝癌細(xì)胞株HepG-2后TGF-β1，VEGF,IL-6 mRNA和蛋白的表達(dá)情況。 7．利用RT-PCR和Western-blot方法分別檢測(cè)和對(duì)比HSP70-腫瘤肽復(fù)合物刺激前后肝癌細(xì)胞株HepG-2中NF-kB mRNA和蛋白的表

5、達(dá)情況。然后檢測(cè)阻斷TLR4受體后HSP70-腫瘤肽復(fù)合物刺激肝癌細(xì)胞株HepG-2后NF-kB mRNA和蛋白的表達(dá)情況。 研究結(jié)果： 1．利用RT-PCR可以檢測(cè)到肝癌細(xì)胞株HepG-2有TLR4 mRNA的表達(dá)；利用Western-blot可以檢測(cè)到肝癌細(xì)胞株HepG-2有TLR4蛋白的表達(dá)。 2．利用免疫組化表明肝癌組織中有TLR4的表達(dá)，其表達(dá)于細(xì)胞的細(xì)胞膜上，細(xì)胞漿中也可以有少量的表達(dá)，其陽(yáng)性率約為7

6、6.7％(23/30)。 3．LPS刺激肝癌細(xì)胞株HepG-2后TGF-β1，VEGF,IL-6 mRNA和蛋白的表達(dá)均增加，而阻斷TLR4受體后TGF-β1，VEGF,IL-6 mRNA和蛋白又下降。 4．LPS刺激肝癌細(xì)胞株HepG-2后NF-kB mRNA和蛋白的表達(dá)均增加，而阻斷TLR4受體后NF-kB mRNA和蛋白又下降。 5．分離、純化得到的蛋白經(jīng)SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳、考馬斯量藍(lán)鑒定為單一帶，

7、分子量為70kD；Western blot結(jié)果證實(shí)為HSP70。每10g組織最終獲得8mg的HSP70。 6．HSP70腫瘤肽復(fù)合物刺激肝癌細(xì)胞株HepG-2后TGF-β1，VEGF,IL-6 mRNA和蛋白的表達(dá)均增加，而阻斷TLR4受體后TGF-β1，VEGF,IL-6 mRNA和蛋白又下降。 7．HSP70腫瘤肽復(fù)合物刺激肝癌細(xì)胞株HepG-2后NF-kB mRNA和蛋白的表達(dá)均增加，而阻斷TLR4受體后NF-kB mRN

8、A和蛋白又下降。 研究結(jié)論： 1．肝細(xì)胞癌細(xì)胞株表面及人肝癌組織有TLR4的表達(dá)。 2．作為T(mén)LR4的外源性配體，LPS可以活化細(xì)胞內(nèi)的NF-kB信號(hào)傳導(dǎo)系統(tǒng)及促進(jìn)細(xì)胞因子TGF-β1，VEGF，IL-6的表達(dá)。 3．使用ConA親和層析和陰離子交換蛋白親和層析二步蛋白純化法可獲得高純度HSP70肽復(fù)合物。 4．作為T(mén)LR4的內(nèi)源性配體，HSP70同樣可以活化細(xì)胞內(nèi)的NF-kB信號(hào)傳導(dǎo)系統(tǒng)及促進(jìn)細(xì)