肝X受體激動劑對Kupffer細胞中TLR4信號通路的影響.pdf

1、目的：通過體外細胞試驗，觀察在枯否細胞（Kupffer Cells，KCs）中活化的肝X受體（Liver X receptors，LXR）在脂多糖（Lipopolysaccharide，LPS）誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)中，對Toll樣受體4（Toll-like receptor-4，TLR4）信號通路中白細胞介素-1受體相關(guān)激酶-4（Interleukin-1 receptor associated kinase-4，IRAK-4）和核因子NF-

2、κB（Nuclear factor-kappaB，NF-κB）的影響，探討LXR激動劑對TLR4信號通路的影響及活化的LXR負性調(diào)控炎癥反應(yīng)的相關(guān)機制。 方法：雄性KM小鼠，用膠原酶原位灌注法分離和培養(yǎng)肝臟Kupffer細胞，獲得的細胞隨機分為①正常對照組、②LPS處理組、③LXR人工合成激動劑T0901317處理組和④LPS+T0901317共同處理組。正常對照組未給任何處理；LPS處理組用含終濃度為1μg/ml LPS的RP

3、MI1640完全培養(yǎng)基培養(yǎng)6h；T0901317處理組用含終濃度為5μg/mlT0901317的RPMI1640完全培養(yǎng)基培養(yǎng)24h；LPS+T0901317共同處理組先用含終濃度為Sμg/ml T0901317的RPMI1640完全培養(yǎng)基培養(yǎng)24h，再用含終濃度為1μg/ml LPS的RPMI1640完全培養(yǎng)基培養(yǎng)6h。所有組均培養(yǎng)至30h。實時-聚合酶鏈式反應(yīng)檢測各組細胞LXR、IRAK-4和NF-κB的mRNA表達水平；免疫細胞化

4、學(xué)和蛋白免疫印跡法檢測LXR、IRAK-4和NF-κB的蛋白質(zhì)表達水平；蛋白免疫印跡法檢測IRAK-4磷酸化活性水平，凝膠電泳遷移率法檢測NF-κB活性水平；酶聯(lián)免疫吸附法檢測各組細胞培養(yǎng)液TNF-α和IL-1β含量。 結(jié)果：①LXR mRNA和蛋白表達水平在LXR激動劑T0901317處理組表達最高（分別為0.9912±0.0098和1.740±0.034），在LPS處理組最低（分別為0.2722±0.0038和0.534±0

5、.014），而聯(lián)合處理組表達居前兩組之間（分別為0.7963±0.0075和1.224±0.027），各組之間蛋白和mRNA表達有明顯差異（p<0.D5）。②IRAK-4 mRNA的水平在LPS處理組最高（3.9238±0.0594），LXR激動劑處理組（0.8756±0.0093）最低，這兩組與其余組差異顯著（p<0.05），在正常對照組（1.7853±0.0267）和聯(lián)合處理組42.0132±0.0406）表達都很低，這兩組之間表達

6、無顯著差異（p>0.05）。IRAK-4蛋白表達水平在LPS處理組最高（0.710±0.018），在LXR激動劑處理組最低（0.102±0.004），這兩組與其余組差異顯著（p<0.05），而正常對照組（0.271±0.008）和聯(lián)合處理組（0.257±0.008）的蛋白表達居于前兩組之間且他們兩組表達無明顯差異（p>0.05），但與LPS處理組和LXR激動劑T0901317處理組有顯著差異（p<0.05）。④NF-κB的mRNA水平在

7、LPS處理組最高（25.2142±0.3501），聯(lián)合處理組較低（11.0173±0.2508），兩者差異顯著（p<0.05），在正常對照組（9.6881±0.1272）和LXR激動劑T0901317處理組（8.9615±0.1723）表達都很低，這三組之間表達無顯著差異（p>0.05）。NF-κB的蛋白表達水平在LPS處理組最高（0.693±0.017），與其余三組差異顯著（p<0.05），而其余三組中蛋白表達較低且他們之間無明顯差異

8、（p>0.05）。④IRAK-4的磷酸化活性形式在正常對照組（0.242±0.008）和LXR激動劑T0901317處理組（0.201±0.007）量很低，兩者無明顯差異（p>0.05），在LPS處理組（0.893±0.019）和聯(lián)合處理組（0.865±0.018）量很高，這兩組也無明顯差異（p>0.05），但與正常對照組和LXR激動劑T0901317處理組差異都很顯著（p>0.05）。NF-κB的相對活性度在正常對照組（24％±1％）

9、和LXR激動劑處理組（28％±1％）很低，這兩組之間無明顯差異（p>0.05），在聯(lián)合處理組活性度（75％±20％高于前兩組，且于前兩組有明顯差異（p<0.05），在LPS處理組活性度最高（100％±0％），與其余各組有顯著差異（p<0.05）。⑤細胞培養(yǎng)上清液中TNF-α（15.45±0.59μg/ml）和IL-1β（20.23±0.64μg/ml）的水平在LPS處理組最高，與其余各組有明顯差異（p<0.05），而正常對照組，LXR激