熒光定量PCR檢測(cè)急性髓細(xì)胞白血病Eps8基因表達(dá)及穩(wěn)定干擾Eps8表達(dá)KG1a的建立.pdf

1、背景:
　　 急性白血病是最常見的惡性腫瘤之一，以疾病發(fā)展迅速，骨髓和（或）外周血中存在大量停留在較早期階段的原始細(xì)胞及早期幼稚細(xì)胞為特點(diǎn)，包括急性髓細(xì)胞白血病(AML)和急性淋巴細(xì)胞白血病(ALL)。在成人急性白血病中，又以AML最為常見。AML一旦發(fā)生，原始細(xì)胞和幼稚細(xì)胞在骨髓及其他造血器官中大量增生累積，干擾骨髓正常造血功能，導(dǎo)致致命性感染、出血和器官浸潤(rùn)，自然病程僅為數(shù)周到數(shù)月。AML病因未明，一般認(rèn)為與環(huán)境污染、射線、

2、藥物等因素有關(guān)。目前AML治療仍以化療為主（急性早幼粒細(xì)胞白血病除外），初始治療的標(biāo)準(zhǔn)誘導(dǎo)化療方案可以使完全緩解(Complete Remission，CR)率達(dá)60％～80％以上。然而，只有20％～30％的患者能夠獲得長(zhǎng)期無(wú)病生存，超過(guò)50％的患者仍終將復(fù)發(fā)，一旦復(fù)發(fā)，死亡率顯著增加。急性白血病患者的5年生存率在中青年患者中只有40％，老年患者則低于10％。復(fù)發(fā)、難治和老年白血病是目前急性白血病治療的主要問(wèn)題。
　　 隨著分子

3、生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展和AML發(fā)病機(jī)制的逐步闡明，發(fā)現(xiàn)了一批與AML發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)的基因并研發(fā)了許多針對(duì)明確致癌基因或位點(diǎn)的藥物，在細(xì)胞水平上攻擊白血病細(xì)胞，如單克隆抗體，酪氨酸激酶抑制劑，法尼基轉(zhuǎn)移酶抑制劑，去甲基化藥物，組蛋白去乙酰化酶等。FLT3(Fms-like tyrosinekinase3，CD135)屬于Ⅲ型受體酪氨酸激酶（receptor tyrosine kinaseⅢ，RTKⅢ）家族成員，研究證實(shí)FLT3的激活突變?cè)贏

4、ML的發(fā)生及疾病的進(jìn)展中起重要的作用，是臨床預(yù)后差的主要指標(biāo)之一。索拉非尼(Sorafenib)通過(guò)抑制具有FLT3-ITD（FLT3內(nèi)部串聯(lián)重復(fù)）突變的白血病細(xì)胞的激酶的活化，造成細(xì)胞周期停滯、凋亡，抑制細(xì)胞增殖，接受索拉非尼治療前后外周血原始細(xì)胞和骨髓原始細(xì)胞比例均下降（分別為7.5％～81％和34％～75.5％）。急性早幼粒細(xì)胞白血病(APL)是人類急性白血病分子靶向治療取得臨床治愈的成功范例。全反式維甲酸(ATRA)和三氧化二砷

5、直接靶向PML-RAR癌蛋白，誘導(dǎo)白血病細(xì)胞分化和凋亡，發(fā)揮特異性抗腫瘤作用。難治性和復(fù)發(fā)白血病的主要原因是白血病細(xì)胞對(duì)化療藥物產(chǎn)生耐受。P-gp蛋白是由多藥耐藥基因MDR1(ABCB1)編碼的依賴ATP的膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白。P-gp由ATP供能，使細(xì)胞內(nèi)藥物泵出細(xì)胞外，減低了細(xì)胞內(nèi)的藥物濃度使細(xì)胞產(chǎn)生耐藥性。研究顯示在AML患者中MDR1高表達(dá)與白血病耐藥相關(guān)，是預(yù)后不良的因素，通過(guò)下調(diào)MDR1表達(dá)水平來(lái)逆轉(zhuǎn)白血病耐藥是改善白血病患者預(yù)后的重

6、要策略。因此，面對(duì)急性白血病日益增高的發(fā)病率以及以分子靶向治療和分層治療的成功，闡明AML新的發(fā)病機(jī)制特別是針對(duì)急性白血病特異性分子改變進(jìn)行有力的干預(yù)，對(duì)于改善治療效果十分重要。
　　 表皮生長(zhǎng)因子受體通路底物8(Epidermal growth factor receptor pathwaysubstrate8，Eps8)是一個(gè)分子量為97KDa的蛋白，是多種酪氨酸激酶的磷酸化底物。Eps8蛋白具有典型的信號(hào)分子的結(jié)構(gòu)，從N端

7、至C端分別為磷酸化酪氨酸結(jié)合區(qū)(PTB)，SH3區(qū)和“效應(yīng)區(qū)”。研究證實(shí)Eps8磷酸化水平增加可促進(jìn)細(xì)胞增殖、遷移及轉(zhuǎn)化。目前已發(fā)現(xiàn)Eps8在眾多實(shí)體腫瘤高表達(dá)，并與腫瘤侵襲及預(yù)后不良有關(guān)。在一個(gè)對(duì)205例口腔鱗狀細(xì)胞癌(OSCC)患者長(zhǎng)達(dá)7年的隨訪中，發(fā)現(xiàn)其中186例存在Eps8持續(xù)表達(dá)，Eps8持續(xù)表達(dá)組5年總生存率為43％，而陰性組為74％，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。在一個(gè)45例宮頸癌患者的研究中，Eps8表達(dá)水平與宮旁浸潤(rùn)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和

8、無(wú)病生存期縮短呈正相關(guān)。同時(shí)，下調(diào)Eps8水平增加宮頸癌細(xì)胞對(duì)化學(xué)藥物的敏感性。在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中，Eps8被證明是促進(jìn)腫瘤細(xì)胞遷移和侵襲的關(guān)鍵分子，通過(guò)RNA干擾的方式沉默Eps8基因使腫瘤細(xì)胞的侵襲能力顯著下降，提示Eps8是潛在的藥物治療的靶點(diǎn)。然而，有關(guān)Eps8在惡性血液疾病特別是AML中的作用仍未清楚。在一個(gè)97例兒童急性淋巴細(xì)胞白血病的臨床研究中，基因芯片分析提示Eps8與無(wú)病生存率(eventfree survival，EF

9、S)相關(guān)，是預(yù)后不良的因素。混合譜系白血病(mixedlineage leukemia, MLL)基因重排是兒童白血病中常見的基因異常改變。在許多由易位突變導(dǎo)致的兒童白血病中，含有MLL基因的染色體在MLL內(nèi)部斷裂并融合成不同的基因。其中，MLL-ABI-1(e3B1)是常見的融合基因，其形成使正常e3B1蛋白功能（抑制細(xì)胞增殖）喪失，而e3B1是Eps8的下游靶點(diǎn)，因此推斷Eps8可能通過(guò)MLL-ABI-1融合基因參與了MLL的發(fā)病。

10、
　　 我們假設(shè)Eps8在AML的發(fā)生發(fā)展中一樣起重要作用。在本實(shí)驗(yàn)中，我們對(duì)Eps8基因進(jìn)行擴(kuò)增并導(dǎo)入到pMD18-T載體中構(gòu)建pMD18-T/Eps8質(zhì)粒作為熒光定量PCR檢測(cè)的標(biāo)準(zhǔn)模板，建立熒光定量PCR檢測(cè)Eps8基因的體系并檢測(cè)AML患者和健康志愿者中Eps8基因的表達(dá)水平。同時(shí)，我們應(yīng)用Western blot分析Eps8在惡性血液病細(xì)胞株的表達(dá)。最后，構(gòu)建Eps8-shRNA慢病毒載體，感染急性髓細(xì)胞白血病細(xì)胞株K

11、G1a，進(jìn)一步研究Eps8在急性髓細(xì)胞白血病中的作用。
　　 目的：
　　 1、建立檢測(cè)Eps8基因的熒光定量PCR方法。
　　 2、檢測(cè)AML患者及健康志愿者中Eps8基因的表達(dá)水平并分析其臨床意義。
　　 3、分析Eps8在惡性血液疾病細(xì)胞株中的表達(dá)。
　　 4、構(gòu)建Eps8-shRNA慢病毒載體并感染急性髓細(xì)胞白血病細(xì)胞株KG1a，構(gòu)建穩(wěn)定沉默Eps8基因的急性髓細(xì)胞白血病細(xì)胞株。
　

12、　 方法:
　　 1、培養(yǎng)KG1a細(xì)胞，提取總RNA，對(duì)Eps8基因進(jìn)行擴(kuò)增并導(dǎo)入到pMD18-T載體中構(gòu)建pMD18-T/Eps8質(zhì)粒載體并作為熒光定量PCR檢測(cè)的標(biāo)準(zhǔn)模板，GAPDH作為內(nèi)參照。
　　 2、將定量標(biāo)準(zhǔn)模板pMD18-T/Eps8和pMD18-T/GAPDH按10倍倍比稀釋進(jìn)行熒光定量PCR反應(yīng)得到標(biāo)準(zhǔn)曲線。采用SYBR Green法得到熔解曲線分析引物的特異性。將質(zhì)粒按梯度稀釋(107、106、10

13、5、104、103、102copies/μL)作為模板，分別進(jìn)行熒光定量PCR擴(kuò)增和常規(guī)PCR擴(kuò)增，對(duì)兩者靈敏度進(jìn)行比較。對(duì)同一批次提取的質(zhì)粒按梯度稀釋(107、106、105、104、103copies/μL)進(jìn)行擴(kuò)增，日內(nèi)重復(fù)3管，不同日期重復(fù)檢測(cè)6次分析該檢測(cè)方法的重復(fù)性。
　　 3、通過(guò)熒光定量PCR對(duì)AML患者及健康志愿者骨髓單個(gè)核細(xì)胞(BMMNCs)的cDNA進(jìn)行擴(kuò)增，通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算得到Eps8跟GAPDH基因的拷

14、貝數(shù)并分析Eps8基因的表達(dá)水平。
　　 4、Western blot分析Eps8在惡性血液病細(xì)胞株的表達(dá)。
　　 5、使用Agel和EcoRI雙酶切，將針對(duì)Eps8的DNA片段連入帶有綠色熒光蛋白和hU6啟動(dòng)子的慢病毒轉(zhuǎn)移質(zhì)粒，采用脂質(zhì)體法進(jìn)行轉(zhuǎn)染轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，48小時(shí)后收集上清并測(cè)定病毒滴度。將慢病毒顆粒按感染復(fù)數(shù)(multiplicity ofinfection，MOI)為100感染KG1a細(xì)胞，24小時(shí)后移除

15、含病毒顆粒培養(yǎng)基，更換新鮮培養(yǎng)基，以嘌呤霉素2μg/ml篩選穩(wěn)定沉默Eps8的KG1a細(xì)胞株并通過(guò)Westernblot檢測(cè)干擾效率。
　　 結(jié)果：
　　 1、利用Trizol提取的KG1a細(xì)胞、AML患者、健康志愿者的總RNA，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳鑒定，可見28S和18S和5S3條完整條帶，證明抽提的RNA質(zhì)量好。RT-PCR擴(kuò)增后終產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳可看到與目的片段大小一致的96bp(Eps8)、143bp(GAPDH

16、)電泳條帶。重組質(zhì)粒經(jīng)基因測(cè)序證實(shí)Eps8及GAPDH基因片段成功克隆到載體中。
　　 2、pMD18-T/Eps8和pMD18-T/GAPDH標(biāo)準(zhǔn)曲線Ct值分別在19.389至35.857（102至107拷貝）循環(huán)，18.736到35.418（102至107拷貝）循環(huán)有良好的線性范圍，相關(guān)系數(shù)為分別為0.999和0.999。SYBR Green法熔解曲線均為單峰，提示擴(kuò)增特異性高。日內(nèi)變異(intra-assay)系數(shù)(coe

17、fficient of variation，CV)為0.83％～1.67％，日間變異(inter-assay)系數(shù)為0.54％～3.80％，重復(fù)性好。熒光定量PCR在Eps8和GAPDH基因的拷貝數(shù)為100時(shí)可以檢測(cè)到特異的擴(kuò)增曲線，而常規(guī)PCR的檢測(cè)下限為103拷貝數(shù)，該熒光定量PCR方法檢測(cè)Eps8基因的敏感性為常規(guī)PCR的10倍。
　　 3、AML患者Eps8基因表達(dá)水平顯著高于健康志愿者。
　　 4、急性髓細(xì)胞白

18、血病患者Eps8基因表達(dá)水平與白細(xì)胞、血小板、血紅蛋白計(jì)數(shù)，是否存在肝脾腫大無(wú)相關(guān)性。Eps8基因高表達(dá)組（Eps8基因表達(dá)大于或等于5倍）初次化療完全緩解率低于Eps8基因低表達(dá)組（Eps8基因表達(dá)低于5倍）。
　　 5、對(duì)5株惡性血液細(xì)胞株Eps8蛋白水平進(jìn)行分析，以MCF-7（人乳腺癌細(xì)胞株）為陽(yáng)性對(duì)照，Eps8在KG1a（人急性髓細(xì)胞白血病細(xì)胞株）、Raji（人淋巴瘤細(xì)胞株）、K562（人慢性粒細(xì)胞白血病細(xì)胞株）表達(dá)，在

19、HL-60（人早幼粒白血病細(xì)胞株）、8662（人多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞株）、健康志愿者骨髓單個(gè)核細(xì)胞不表達(dá)，表達(dá)水平分析提示Eps8在KG1a高表達(dá)。
　　 6、慢病毒包裝并能成功感染包裝293T細(xì)胞，在感染復(fù)數(shù)(multiplicity ofinfection，MOI)為100的含polybrene為5μg/ml的感染增強(qiáng)溶液(Enhanced InfectionSolution，ENi.S.)中，熒光顯微鏡下觀察Eps8-shRN

20、A慢病毒轉(zhuǎn)染效率達(dá)85％。Western blot檢測(cè)顯示，Eps8-shRNA慢病毒感染后KG1a細(xì)胞使Eps8蛋白表達(dá)量下降80％。
　　 結(jié)論：
　　 1、成功建立檢測(cè)Eps8基因表達(dá)的熒光定量PCR方法。
　　 2、AML患者Eps8基因表達(dá)水平顯著高于健康志愿者。
　　 3、AML患者Eps8基因高表達(dá)組（Eps8基因表達(dá)大于或等于5倍）初次化療CR率低于Eps8基因低表達(dá)組（Eps8基因表達(dá)低