羅格列酮通過下調IGF-1的表達抑制非小細胞肺癌的淋巴轉移并誘導凋亡.pdf

1、隨著對PPARs基因的深入了解，PPARγ在腫瘤中的作用日益成為學者們研究的焦點，有不少研究證明，其激動劑在乳腺癌、結腸癌、胃癌、前列腺癌研究中能夠促進腫瘤細胞的凋亡，淋巴結轉移是非小細胞肺癌患者術后復發(fā)和死亡等預后不良的重要因素[1-3]。其中PPARγ的特異性配體能誘導多種腫瘤的終末分化,抑制腫瘤細胞的增殖，在脂肪肉瘤和前列腺癌患者的臨床治療中，PPARγ配體已經顯示了良好的抑制腫瘤效果。隨著淋巴管內皮特異標記物和淋巴管生長因子的發(fā)

2、現，NSCLC誘發(fā)淋巴管生成的分子機制和以淋巴管生成(lymphangiogenesis)作為抗腫瘤轉移靶點的研究已成為目前研究的熱點之一，抑制腫瘤新生淋巴管可能為控制非小細胞肺癌淋巴道轉移提供新的思路，為此，本研究選擇跟PPARγ表達有關的非小細胞肺癌腫瘤細胞系A549細胞，來證實羅格列酮通過下調IGF-1的表達來抑制非小細胞肺癌的淋巴轉移及誘導凋亡，意在尋找治療非小細胞肺癌的一種更好的方法和藥物。
　　 胰島素樣生長因子(I

3、nsulin-like growth factor，IGF)特別是IGF1不僅能夠促進非小細胞肺癌的無限增殖，而且與淋巴結轉移的關系密切，IGF-1可作為非小細胞肺癌生物學行為尤其是淋巴結轉移的判斷指標。羅格列酮是過氧化物酶體增殖激活受體γ(PPARγ)激動劑，它能夠誘導非小細胞肺癌凋亡并抑制非小細胞肺癌細胞侵襲及轉移。并且，羅格列酮已被證明能夠通過PI3K/Akt途徑抑制乳腺癌細胞中IGF-I的表達。據此我們推測羅格列酮可能通過抑制I

4、GF-I的來抑制肺癌細胞的淋巴轉移。為此，本試驗觀察羅格列酮作用與A549細胞后IGF-1的表達，研究并探討羅格列酮抑制非小細胞肺癌增值及轉移的機制。
　　 【研究目的】
　　 探討羅格列酮通過下調IGF-1的表達來抑制非小細胞肺癌的淋巴轉移及誘導凋亡。
　　 【研究方法】
　　 1. A549細胞的培養(yǎng)及羅格列酮對A549細胞的處理；
　　 2.采用Hoechst3222染色法檢測羅格列酮對肺癌

5、A549細胞凋亡的影響：轉染后48小時，Hoechst3222染色，于熒光倒置顯微鏡下觀測胞核變化。分別取5個高倍鏡視野，計數凋亡變化的細胞個數所占比例為凋亡率，取平均值，并與空白對照組細胞做比較。重復研究3次；
　　 3.透射電鏡觀察細胞超微結構的改變；
　　 4. Real time PCR檢測羅格列酮對A549細胞VEGF-C表達的影響；
　　 5.采用免疫熒光化學法觀察羅格列酮處理A549細胞后VEGF-

6、C的表達：
　　 6. Western blot對下調后的IGF-1進行半定量分析:羅格列酮處理細胞24小時后，提取細胞的總蛋白，Bicinchoninic acid assay(BCA)蛋白測定試劑盒測定蛋白濃度。進行SDS-PAGE電泳，目的條帶用AlphaEaseFC軟件分析系統進行灰度值分析。PPARγ條帶與actin條帶吸光度的比值表示蛋白表達量；
　　 7.對結果進行統計學分析，采用均數±標準差的方式對數據進

7、行描述，凋亡率采用x2分析，VEGF-C及IGF-1的表達采用方差分析。
　　 【研究結果】
　　 1.羅格列酮誘導A549細胞凋亡呈濃度依賴性，濃度分別為0，10，20，30μM的羅格列酮，處理48小時后，凋亡率分別為0.012±0.033、0.105±0.177、0.388±0.201、0.437±0.189; A549細胞在在處理后出現早期核凋亡改變，核膜皺縮，成波浪狀，染色體凝集成塊狀。48小時后，凋亡細胞明顯增

8、加，染色質致密濃染呈粗大的顆粒狀，邊集，或整個核呈輻輪狀；有些細胞已有凋亡小體突出；或整個細胞核致密濃染，或分裂成凋亡小體。并用透射電鏡觀察細胞超微結構的改變
　　 2.羅格列酮下調VEGF-C的表達，羅格列酮作用48小時后，可見處理組的熒光比空白組明顯減弱，而陰性對照組未見特異性熒光表達。
　　 3.羅格列酮下調IGF-1的表達成濃度依賴性，羅格列酮處理A549細胞24小時后， IGF-1的表達量分別為0.761±0.