針對HER2-neu的siRNA對非小細胞肺癌生長的抑制作用.pdf

1、肺癌的死亡率在世界范圍內居惡性腫瘤首位，近年雖然來出現了一些新的化療藥物，但其治愈率仍然低于15％。HER2/neu(erbB2)基因，編碼蛋白大小為185KDa，具有酪氨酸蛋白激酶活性，為表皮生長因子受體(EGFR)家族成員，與EGFR高度同源。HER2/neu蛋白可以與家族其他成員形成異源二聚體，從而發(fā)揮強有力的腫瘤信號傳導作用。研究顯示，HER2/neu介導的信號傳導與腫瘤的形成、增殖、轉移、侵襲及放化療耐受有關。約1/3非小細胞

2、肺癌(NSCLC)存在HER2/neu過表達，其在NSCLC形成、增殖、轉移、侵襲等方面的作用尚需進一步研究證實。 RNA干涉(RNAi)是雙鏈RNA(dsRNA)介導的、序列特異的轉錄后基因沉默(PTGS)現象，廣泛存在于多種自然界。RNAi的核心功能是抗病毒感染免疫，維持基因組中轉座子的穩(wěn)定性，清除異常RNA，同時參與基因表達調控。目前，RNAi技術己發(fā)展成為一種新型的基因阻斷技術，用于高效特異地關閉或降低特定基因的表達，已

3、被廣泛用于新基因篩選、基因功能鑒定以及基因治療等方面，在腫瘤、病毒感染等治療方面已取得積極進展，顯示了非常廣闊的應用前景。但是針對HER2/neu的RNAi對NSCLC的研究報道少見。 研究目的 本研究利用siRNA沉默肺癌細胞HER2/neu表達后，通過體外體內系列實驗觀察腫瘤細胞生物學行為的改變，了解HER2/neu基因在肺癌發(fā)生、發(fā)展中的作用，檢測RNA干涉效果并探討該方法應用于肺癌基因治療的潛在應用價值，為肺癌的

4、治療提供一條新思路。 研究內容 1.根據人HER2/neumRNA基因編碼區(qū)序列，首先設計并合成針對HER2/neu的兩兩互補的4條64nt的小發(fā)夾RNA(shRNA)模板脫氧寡核苷酸序列，然后構建針對HER2/neu的siRNA表達質粒pSUPER-siHER1和pSUPER-siHER2，并進行酶切鑒定和DNA測序；其次將構建正確的pSUPER-siHER2載體中的H1啟動子連同編碼siRNA的模板序列用EcoRI和

5、XhoI切出，再連接入去除CMV啟動子的pcDNA3.0載體，構建成帶有新霉素抗性篩選標志的pcDNA3.0-siHER2表達質粒，并進行酶切鑒定。 2.利用WesternBlot、間接免疫熒光染色和RT-PCR方法對4株NSCLC細胞系Calu-3、SPC-A-1、A549和PLA-801進行HER2/neu蛋白和mRNA表達水平的檢測。 3.應用增強綠色熒光蛋白表達質粒pEGFP-3轉染Calu-3和SPC-A-1細

6、胞，檢測質粒對細胞的轉染效率。 4.將siRNA表達質粒pSUPER-siHER2與pcDNA3.0空載體按摩爾比10：1瞬時共轉染或將重組質粒pcDNA3.0-siHER2瞬時轉染過表達HER2/neu的SPC-A-1細胞。轉染后72h收集細胞，用RT-PCR和Westernblot檢測HER2/neumRNA和蛋白水平表達，并觀察導入的siRNA對細胞周期和細胞生長速度的影響。 5.將pSUPER-siHER2或pc

7、DNA3.0-siHER2穩(wěn)定轉染肺腺癌SPC-A-1、Calu-3細胞，400μg/mlG418抗性篩選SPC-A-1以獲得穩(wěn)定的單克隆細胞株；50μg/mlG418抗性篩選Calu-3；RT-PCR檢測細胞HER2/neumRNA的表達；免疫熒光染色和WesternBlot檢測細胞HER2/neu蛋白表達；FCM檢測細胞周期分布；集落形成實驗觀察單細胞增殖能力；MTT法繪制細胞生長曲線觀察體外細胞的增殖能力，并利用WesternBl

8、ot方法動態(tài)觀察siRNA對HER2/neu的長期抑制作用。 6.裸鼠體內成瘤實驗：將單克隆細胞株按7×106接種裸鼠皮下，觀察出瘤情況，至出現瘤塊后每3d測量一次腫瘤大小，第32d結束實驗，計算腫瘤生長抑制率包括瘤體抑制率和瘤重抑制率。 結果 1.酶切鑒定結果顯示重組質粒的插入片段大小與預期相符，表明脫氧寡核昔酸片段己克隆入重組質粒；DNA測序證實該重組質粒序列與所設計序列完全一致，表明針對HER2/neu的s

9、iRNA表達載體己構建成功，重組質粒分別命名為pSUPER-siHER1，pSUPER-siHER2和pcDNA3.0-siHER2。 2.4株NSCLC均存在HER2/neu表達，其中首次證實肺腺癌SPC-A-1和肺大細胞癌PLA-801HER2/neu表達陽性，并且Calu-3和SPC-A-1存在HER2/neu蛋白和mRNA水平的過表達。 3.應用綠色熒光蛋白報告基因質粒pEGFP-3轉染Calu-3和SPC-A-

10、1細胞，發(fā)現SPC-A-1細胞轉染效率達到59.56％，適合脂質體轉染；而Calu-3細胞轉染效率僅約1％，不適合脂質體瞬時轉染研究。 4.將針對HER2/neu的siRNA重組質粒穩(wěn)定轉染肺腺癌SPC-A-1、Calu-3細胞，400μg/mlG418抗性篩選SPC-A-1獲得了穩(wěn)定表達HER2/neusiRNA的多株單克隆細胞株；而50μg/mlG418抗性篩選Calu-3長達4個月，始終未獲得穩(wěn)定的單克隆細胞株。

11、5.將針對HER2/neu的siRNA重組質粒瞬時轉染SPC-A-1細胞，HER2/neumRNA和蛋白質水平表達受抑制，siRNA主要阻抑細胞于G0/G1期，細胞生長速度減慢。 6.將針對HER2/neu的siRNA重組質粒穩(wěn)定轉染SPC-A-1細胞經G418抗性篩選獲了多株穩(wěn)定表達siRNA的單克隆細胞株，結果表明：①2種siRNA均能明顯降低HER2/neumRNA的表達，轉染組幾乎完全受到抑制；②siRNA顯著抑制細胞H

12、ER2/neu蛋白質合成；③細胞G0/G1期細胞增加，S期細胞減少；④細胞生長曲線左移、增殖速度明顯減慢；⑤體外單細胞細胞集落形成能力顯著下降，集落形成抑制率達到49.0％；⑥對細胞HER2/neu表達的持久、動態(tài)觀察發(fā)現，單克隆細胞株在長達4個月的培養(yǎng)過程中對HER2/neu的抑制率幾乎維持不變，表明穩(wěn)定轉染針對HER2/neu的siRNA能夠持久、高效地抑制肺癌細胞HER2/neu基因的表達。 7.體內實驗結果顯示：針對HE

13、R2/neu的siRNA表達質粒明顯抑制了裸鼠體內肺腺癌腫瘤形成及增長速度，瘤重抑制率達到57％，瘤體抑制率達到51％。 結論 1.設計、合成了兩個針對HER2/neu的特異性siRNA脫氧寡核甘酸序列，構建了HER2/neu的siRNA表達質粒，建立和篩選出了穩(wěn)定表達HER2/neusiRNA的單克隆細胞株。 2.證實4株細胞均存在HER2/neu表達，其中首次檢測到SPC-A-1和PLA-801的HER2/n

14、eu表達陽性，Calu-3和SPC-A-1同時存在HER2/neumRNA和蛋白水平的過表達。 3.體外實驗結果表明，我們設計的針對HER2/neu的重組質粒產生的siRNA能夠穩(wěn)定、高效、特異、持久地抑制肺癌細胞SPC-A-1HER2/neu表達，阻滯細胞于G0/G1期，顯著抑制細胞增殖能力和集落形成能力。 4.體內實驗結果顯示，針對HER2/neu的siRNA可以有效抑制裸鼠移植瘤ER2/neu表達和移植瘤增殖速度。