特異性HER-2 siRNA對(duì)BT-474細(xì)胞抑制作用的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、南方醫(yī)科大學(xué)博士學(xué)位論文特異性HER2siRNA對(duì)BT474細(xì)胞抑制作用的實(shí)驗(yàn)研究姓名：張緒慧申請(qǐng)學(xué)位級(jí)別：博士專業(yè)：腫瘤學(xué)指導(dǎo)教師：羅榮城20070416中文摘要效的替代基因敲除的工具，它在功能基因組學(xué)研究、基因治療等領(lǐng)域越來(lái)越得到更多的重視。。本研究選擇HER02過(guò)表達(dá)的乳腺癌BT珥74細(xì)胞株為研究對(duì)象，應(yīng)用RNAi技術(shù)沉默該BT474細(xì)胞中的HER2基因，觀察其抗癌的作用，并對(duì)其作用機(jī)制進(jìn)行了初步探討研究目的：設(shè)計(jì)并構(gòu)建針對(duì)HER

2、2mRNA的特異性RNA干擾質(zhì)粒載體，建立穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞株，通過(guò)體外和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)研究特異性HER2siRNA對(duì)BT474細(xì)胞HER2的干擾作用，及其對(duì)BT珥74細(xì)胞的抑制作用，為RNAi技術(shù)用于防治乳腺癌提供基礎(chǔ)的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。研究方法：1根據(jù)人HER2mRNA基因編碼區(qū)序列，設(shè)計(jì)并合成針對(duì)HER2的3條小發(fā)夾RNA(shRNA)]溪板脫氧寡核苷酸序列(siRSAI、siRNA2及siRNA3)和l條作為負(fù)對(duì)照的無(wú)關(guān)序列(siRNAneg)。

3、利用pRNATU61／Neo載體質(zhì)粒構(gòu)建了3種特異性HER2siRNA質(zhì)粒(pRNATU61／NeosiRNA1、pRNATU61／NeosiRNA2及pRNATU61／Neo—siRNA3)和1種無(wú)關(guān)序列質(zhì)粒pRNATU61／NeosiRNAneg2通過(guò)陽(yáng)性克隆PCR鑒定及DNA測(cè)序鑒定來(lái)驗(yàn)證構(gòu)建的重組質(zhì)粒是否符合實(shí)驗(yàn)要求。3在陽(yáng)離子脂質(zhì)體介導(dǎo)下，用重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HER2過(guò)表達(dá)的人乳腺癌BT珥74細(xì)胞株，篩選出陽(yáng)性穩(wěn)定轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒的細(xì)胞

4、進(jìn)行克隆，分別采用RTPCR和Westernblot技術(shù)檢測(cè)HEI沌mRNA和HER2蛋白表達(dá)的交化，用M，盯比色法和平板克隆形成試驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞增殖活性，采用流式細(xì)胞儀測(cè)定細(xì)胞周期變化和細(xì)胞凋亡情況，采用運(yùn)動(dòng)小室實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)侵襲能力4用穩(wěn)定轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒的BT珥74細(xì)胞建立裸鼠皮下移植瘤模型，觀察腫瘤生長(zhǎng)情況，測(cè)量腫瘤體積，繪制腫瘤生長(zhǎng)曲線，接種后第30d處死裸鼠并剝離瘤體，稱量瘤體重量并計(jì)算抑瘤率，采用RTPCR檢測(cè)HER2基因水平