Fank1基因敲減小鼠睪丸組織ApoC2表達(dá)下調(diào)機(jī)制的研究.pdf

1、精子發(fā)生是一個(gè)高度復(fù)雜而有序的多基因調(diào)控的細(xì)胞分化過程。已證實(shí)很多基因如Fank1,Spem1、RIM-BP3,DAZAP1、TSPY1等都參與精子發(fā)生,研究這些基因的功能及表達(dá)調(diào)控通路對(duì)認(rèn)識(shí)精子發(fā)生的機(jī)制有重要的意義。
　　 Fank1是睪丸組織特異表達(dá)的一種核蛋白,從精子發(fā)生過程的減數(shù)分裂到單倍體階段持續(xù)表達(dá),通過調(diào)控下游基因的表達(dá)發(fā)揮重要的作用。睪丸組織Fank1蛋白能夠激活轉(zhuǎn)錄因子AP1的轉(zhuǎn)錄活性,從而影響下游靶基因的表

2、達(dá)。轉(zhuǎn)錄因子AP1包括四個(gè)家族,分別是c-Jun、c-Fos、ATF和JDP家族,在四個(gè)家族成員中,c-Jun具有很強(qiáng)的轉(zhuǎn)錄活性,在細(xì)胞增殖、分化和凋亡過程中發(fā)揮作用。載脂蛋白C2(ApoC2)是載脂蛋白C家族中最重要的亞類之一,它可以通過激活下游的脂蛋白脂肪酶(LPL)參與脂類轉(zhuǎn)運(yùn)及代謝,在哺乳動(dòng)物生殖過程中發(fā)揮重要的作用。
　　 本實(shí)驗(yàn)室前期工作中,通過基因芯片技術(shù)分析Fank1基因敲減小鼠睪丸組織的基因表達(dá)譜,發(fā)現(xiàn)Fank

3、1表達(dá)下降的同時(shí),AP1(c-Jun)、ApoC2、LPL表達(dá)下調(diào),提示睪丸組織中AP1(c-Jun)、ApoC2和LPL的表達(dá)受到Fank1表達(dá)水平的影響,這些基因組成的調(diào)控通路可能在精子發(fā)生過程中發(fā)揮重要作用。目前對(duì)小鼠ApoC2啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄活性及Fank1與ApoC2的調(diào)控關(guān)系還未見報(bào)道,因此本研究擬采用RT-PCR以及細(xì)胞轉(zhuǎn)染和雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)等方法對(duì)Fank1基因敲減小鼠睪丸組織中ApoC2表達(dá)下調(diào)的機(jī)制進(jìn)行研究。

4、>　　 材料與方法：
　　 一、實(shí)驗(yàn)材料
　　 1、pGL3-Basic、pRL-TK、pcDNA3.0載體;
　　 2、人胚腎293T細(xì)胞;
　　 3、細(xì)胞培養(yǎng)及細(xì)胞轉(zhuǎn)染相關(guān)試劑;
　　 4、分子克隆及PCR相關(guān)試劑;
　　 5、SPF級(jí)C57BL/6J小鼠;
　　 6、雙熒光素酶檢測(cè)試劑盒。
　　 二、實(shí)驗(yàn)方法
　　 (一)RT-PCR驗(yàn)證Fank1基因敲減小

5、鼠睪丸組織基因芯片結(jié)果
　　 提取Fank1基因敲減小鼠睪丸組織總RNA,利用RT-PCR方法對(duì)基因芯片結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證。
　　 (二)ApDC2啟動(dòng)子及轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)的預(yù)測(cè)
　　 1、用啟動(dòng)子預(yù)測(cè)軟件http://www.fruitfly.org/seq_tools/promoter.html分析C57BL/6J小鼠ApoC2(Gene Bank Gene ID:11813)-2000bp～+700bp區(qū)域,預(yù)測(cè)

6、啟動(dòng)子序列。
　　 2、用轉(zhuǎn)錄因子預(yù)測(cè)網(wǎng)站http://www.cbil.upenn.edu/cgi-bin/tess/tess對(duì)ApoC2啟動(dòng)子-1959bp～+470bp區(qū)域進(jìn)行分析,預(yù)測(cè)此區(qū)域轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)。
　　 (三)小鼠ApoC2啟動(dòng)子不同區(qū)域熒光素酶表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建
　　 1、根據(jù)啟動(dòng)子預(yù)測(cè)結(jié)果設(shè)計(jì)7對(duì)PCR引物,以C57BL/6J小鼠基因組DNA為模板,擴(kuò)增7段啟動(dòng)子區(qū)域不同長(zhǎng)度的DNA片段,將片

7、段克隆至pGL3-Basic載體中,構(gòu)建ApoC2啟動(dòng)子不同區(qū)域熒光素酶表達(dá)質(zhì)粒。
　　 (四)pcDNA3.0-Fank1及pcDNA3.0-c-Jun真核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建
　　 利用RT-PCR的方法從C57BL/6J小鼠睪丸組織中擴(kuò)增Fank1及c-Jun基因cDNA全長(zhǎng)序列,構(gòu)建pcDNA3.0-Fank1及pcDNA3.0-c-Jun真核表達(dá)質(zhì)粒。
　　 (五)細(xì)胞轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)
　　 1、細(xì)胞水平驗(yàn)證

8、Fank1對(duì)c-Jun、ApoC2表達(dá)的影響
　　 將pcDNA3.0-Fank1表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞,利用RT-PCR的方法檢測(cè)Fank1、c-Jun、ApoC2在293T細(xì)胞中的表達(dá)。
　　 2、細(xì)胞水平驗(yàn)證c-Jun對(duì)ApoC2表達(dá)的影響
　　 將pcDNA3.0-c-Jun表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞,利用RT-PCR的方法檢測(cè)ApoC2在293T細(xì)胞中的表達(dá)。
　　 3、ApoC2啟動(dòng)子不同區(qū)域

9、轉(zhuǎn)錄活性分析
　　 將含ApoC2不同啟動(dòng)子DNA片段的熒光素酶表達(dá)質(zhì)粒pGL3-ApoC2-X分別和海腎熒光素酶表達(dá)質(zhì)粒pRL-TK共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞,進(jìn)行ApoC2啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄活性分析。
　　 4、轉(zhuǎn)錄因子Fank1對(duì)ApoC2啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄活性的影響
　　 將pcDNA3.0-Fank1表達(dá)質(zhì)粒分別與ApoC2啟動(dòng)子熒光素酶表達(dá)質(zhì)粒pGL3-ApoC2-X和海腎熒光素酶表達(dá)質(zhì)粒pRL-TK共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞,進(jìn)行

10、啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄活性分析。
　　 5、轉(zhuǎn)錄因子AP1(c-Jun)對(duì)ApoC2啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄活性的影響
　　 將pcDNA3.0-c-Jun表達(dá)質(zhì)粒分別與含ApoC2啟動(dòng)子熒光素酶表達(dá)質(zhì)粒pGL3-ApoC2-X和海腎熒光素酶表達(dá)質(zhì)粒pRL-TK共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞,進(jìn)行啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄活性檢測(cè)。
　　 結(jié)果：
　　 一、RT-PCR結(jié)果顯示,Fank1基因敲減小鼠睪丸組織中c-Jun基因表達(dá)下調(diào),ApoC2基因表達(dá)下調(diào),

11、LPL基因表達(dá)下調(diào)。
　　 二、啟動(dòng)子預(yù)測(cè)結(jié)果顯示,ApoC2啟動(dòng)子位于-1959bp～+470bp區(qū)域;轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)分析結(jié)果顯示,ApoC2啟動(dòng)子-1959bp～+470bp區(qū)域有AP1轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)。
　　 三、酶切及測(cè)序顯示,ApoC2啟動(dòng)子不同區(qū)域熒光素酶表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建成功。
　　 四、酶切及測(cè)序顯示,pcDNA3.0-Fank1及pcDNA3.0-C-Jun表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建成功。
　　 五、細(xì)胞

12、轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)
　　 1、pcDNA3.0-Fank1表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞,RT-PCR結(jié)果顯示c-Jun、ApoC2表達(dá)增加。
　　 2、pcDNA3.0-c-Jun表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞,RT-PCR結(jié)果顯示c-Jun、ApoC2表達(dá)增加。
　　 3、ApoC2啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄活性分析顯示,pGL3-ApoC2-F活性最強(qiáng),pGL3-ApoC2-E、pGL3-ApoC2-G、pGL3-ApoC2-C次之,pGL3-

13、ApoC2-A、pGL3-ApoC2-B和pGL3-ApoC2-D活性很弱。
　　 4、雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)結(jié)果顯示,Fank1對(duì)ApoC2啟動(dòng)子-1959bp～+470bp區(qū)域無明顯作用。
　　 5、雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)結(jié)果顯示,c-Jun對(duì)ApoC2啟動(dòng)子-1959bp～+470bp區(qū)域有正調(diào)控作用。
　　 結(jié)論：
　　 1、Fank1基因敲減小鼠睪丸組織中AP1(c-Jun)、ApoC2基因表達(dá)