ART操作對(duì)雄性小鼠睪丸組織基因表達(dá)和脂類(lèi)代謝影響及其機(jī)理研究.pdf

1、第一部分 ART小鼠睪丸組織基因表達(dá)改變及跨代傳遞研究
　　 已有的研究報(bào)告表明通過(guò)卵胞漿內(nèi)單精子注射(intracytoplasmic sperminjection，ICSI)等輔助生殖技術(shù)(assisted reproductive techniques，ART)出生的男性后代，存在生殖道畸形發(fā)生率增加、精液質(zhì)量下降和生殖功能相關(guān)基因表達(dá)異常等改變。然而由于遺傳背景和生活環(huán)境的差異、加上倫理法律的限制，利用人類(lèi)臨床資料很難明

2、確各項(xiàng)ART操作對(duì)男性生殖健康的影響。故此我們利用近交系小鼠，分別建立控制性超促排卵（controlled ovarian hyperstimulation，COH）、體外受精（in vitro fertilization and embryo-transfer, IVF-ET）和ICSI動(dòng)物模型，對(duì)新生ART小鼠睪丸組織的基因的表達(dá)做進(jìn)一步分析。
　　 首先以自然出生小鼠為對(duì)照，應(yīng)用表達(dá)芯片對(duì)通過(guò)ICSI受精出生的新生小鼠睪丸

3、組織基因表達(dá)譜進(jìn)行了分析。在芯片篩出的差異基因中，聚焦與男性生殖健康相關(guān)的8個(gè)非印記基因(Dmc1、Prok2、Rec8、Rhox5、Spo11、 Adcyap1r1、Amh和Pdgfra)及6個(gè)父源表達(dá)的印記基因(Igf2、Kcnq1ot1、Mest、Peg3、Plagl1和Snrpn)，應(yīng)用RT-PCR檢測(cè)這些基因在COH、IVF、ICSI出生成年小鼠（F1代），及其與自然出生小鼠交配出生的ART F2代小鼠睪丸組織中的表達(dá);利用焦

4、磷酸測(cè)序等檢測(cè)F1代和-F2代小鼠睪丸中印記基因差異甲基化區(qū)域的甲基化修飾狀態(tài)。
　　 結(jié)果顯示:(1)對(duì)于ICSI新生小鼠中表達(dá)下調(diào)的男性生殖健康相關(guān)的8個(gè)非印記基因，其差異可持續(xù)到成年F1代小鼠，而在新生鼠中表達(dá)上調(diào)的基因在成年到恢復(fù)正常的表達(dá)水平。6個(gè)父源表達(dá)的印記基因中印記基因Kcnq1ot1、Mest、Peg3、Plagl1和Snrpn在ICSI成年F1代小鼠睪丸組織中表現(xiàn)出低表達(dá)和高甲基化。IVF成年小鼠的基因表達(dá)和

5、甲基修飾改變與ICSI類(lèi)似。(2)自然妊娠、COH、IVF和ICSI F1代小鼠之間還進(jìn)行兩兩比較，分析不同ART處理對(duì)子代睪丸基因表達(dá)的影響，結(jié)果顯示超促排卵、體外胚胎和ICSI機(jī)械刺激在不同程度上都可以影響睪丸基因表達(dá)水平。其中體外培養(yǎng)和機(jī)械刺激是造成父源印記基因表達(dá)下調(diào)的主要原因。對(duì)于非印記基因的表達(dá)下調(diào)，三個(gè)因素具有累加效應(yīng)。(3) ICSI和IVF F1代小鼠中存在的印記基因表達(dá)和修飾改變，多數(shù)在F2代小鼠的睪丸組織中仍然可見(jiàn)

6、。ART F1代存在的非印記基因表達(dá)改變多數(shù)在ICSI F2代仍可見(jiàn)，然而在IVF F2中已恢復(fù)正常。
　　 結(jié)論:ICSI操作引起的小鼠睪丸基因表達(dá)改變，部分可延續(xù)到成年小鼠，其中成年小鼠睪丸間質(zhì)和支持細(xì)胞的基因表達(dá)改變可能更為明顯。超促排卵、體外培養(yǎng)和ICSI機(jī)械刺激等ART操作可在不同程度上影響出生小鼠睪丸基因表達(dá)。ART操作引起的小鼠睪丸基因表達(dá)改變機(jī)理涉及基因甲基化表觀遺傳修飾，并且睪丸基因表達(dá)和甲基化修飾改變可跨代傳

7、遞，尤以ICSI為著。
　　 第二部分 ART雄性小鼠脂肪酸代謝的變化及機(jī)理研究
　　 作為三大代謝之一，脂類(lèi)代謝在宮內(nèi)胎兒生長(zhǎng)發(fā)育中作用重要。大量臨床研究指出行輔助生殖技術(shù)(assisted reproductive techniques，ART)出生子代存在出生體重異常的現(xiàn)象，同時(shí)對(duì)ART受孕分娩胎盤(pán)的觀察表明，此類(lèi)妊娠易發(fā)胎盤(pán)形狀和重量異常，可能影響胎盤(pán)脂類(lèi)代謝，限制母嬰間甾類(lèi)激素的傳遞，改變胎兒正常的脂類(lèi)代謝過(guò)程

8、。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)ART新生雄性小鼠存在出生高體重，因此在第二部分繼續(xù)探討ART男性子代的健康狀況，并將重點(diǎn)放在ART雄性后代脂肪酸代謝上。此外，在這部分中還將就ART小鼠脂肪酸代謝改變的機(jī)理做初步探索。
　　 首先利用已建立的控制性超促排卵(controlled ovarian hyperstimulation，COH)、體外受精（in vitro fertilization and embryo-transfer, IV

9、F-ET）和卵胞漿內(nèi)單精子注射(intracytoplasmic sperm injection，ICSI)小鼠模型，對(duì)出生成年和老年雄性小鼠肝臟和脂肪組織中的脂肪酸組成、脂肪酸合成和分解代謝酶類(lèi)相關(guān)基因進(jìn)行了檢測(cè)，并通過(guò)脂肪酸組成相關(guān)性分析探討脂肪酸代謝相關(guān)酶的活性對(duì)脂肪酸組成的影響。其次，用兩個(gè)劑量的促性腺激素對(duì)小鼠進(jìn)行超排處理，檢測(cè)胚胎的得率、脂類(lèi)的分布和含量、脂肪酸組成以及甘油三脂代謝相關(guān)酶類(lèi)的表達(dá)。同時(shí)檢測(cè)促排組血清孕酮及卵巢

10、膽固醇含量，分析其對(duì)胚胎脂代謝變化的影響。
　　 結(jié)果發(fā)現(xiàn):(1)與對(duì)照組-自然妊娠出生小鼠相比，三類(lèi)ART小鼠的脂肪組織和肝臟組織的脂肪酸組成差異明顯。各ART成年小鼠脂肪組織SFAs和MUFAs含量增加，PUFAs含量減少，而三類(lèi)ART成年小鼠肝臟組織脂肪酸組成變化不盡相同。并且上述差異隨小鼠年齡增加而改變。(2)脂肪酸代謝相關(guān)酶的活性和表達(dá)不僅在各組之間發(fā)生變化，而且隨年齡的增長(zhǎng)也有所改變。通過(guò)相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)脂肪酸代謝相關(guān)

11、酶可能是通過(guò)調(diào)節(jié)肝臟中C16∶0和脂肪組織中C18∶0的含量影響脂肪酸的組成。在脂肪組織中無(wú)論是成年還是老年三個(gè)ART組中脂肪酸合成相關(guān)基因的表達(dá)水平變化都是一致的，而且脂肪酸合成相關(guān)基因的表達(dá)在自然妊娠組隨年齡增長(zhǎng)而增加，在三個(gè)ART組隨年齡增長(zhǎng)而降低。(3)胚胎中出現(xiàn)促性腺激素依賴(lài)性的脂類(lèi)聚集、脂肪酸合成下降以及激素劑量依賴(lài)性的脂肪酸組成的改變。
　　 結(jié)論:ART過(guò)程可改變成年雄性小鼠脂肪和肝臟組織的多種脂肪酸含量，影響相