Usp9y基因在小鼠睪丸中的表達(dá)及其在雄性不育中的作用和分子機(jī)制的初步研究.pdf

1、男性不育是一種具有遺傳基礎(chǔ)的復(fù)雜疾病，雄性動物模型、突變基因篩選等相關(guān)研究已證實了精子發(fā)生障礙遺傳學(xué)病因的普遍性。精子發(fā)生過程中受許多基因的精細(xì)調(diào)控,基因缺失或突變均可導(dǎo)致精子發(fā)生過程中斷。由遺傳缺陷(包括基因突變和染色體異常)引起的精子發(fā)生障礙約占男性不育癥患者總數(shù)的30％以上。Y染色體上的基因缺陷是導(dǎo)致男性生精障礙的重要因素之一,其中無精子癥因子(azoospermia factor,AZF)區(qū)的基因缺失與男性不育關(guān)系十分密切。泛素

2、特異性蛋白酶9y(ubiquitin specific peptidase9,Y-linked)基因是AZF區(qū)的重要基因之一，研究顯示泛素-蛋白酶體系統(tǒng)參與精子發(fā)生的不同階段包括有絲分裂，減數(shù)分裂和減數(shù)分裂后階段的發(fā)生過程，在整個精子的形成過程中發(fā)揮重要作用，近年來相關(guān)研究表明USP9Y基因的缺失和突變與不育男性無精子癥和嚴(yán)重少精子癥之間存在密切聯(lián)系。明確USP9Y基因的功能及其在雄性不育中的分子作用機(jī)制,將為臨床男性不育提供早期和確切

3、診斷、合理的治療方法以及遺傳咨詢提供理論基礎(chǔ)。
　　目的：通過檢測Usp9y在小鼠不同發(fā)育時期各種組織以及睪丸發(fā)育相關(guān)細(xì)胞株中的表達(dá)，明確該基因的表達(dá)與定位；結(jié)合生物信息學(xué)分析，探究Usp9y的功能；研究Usp9y在pcd雄性不育小鼠睪丸中的表達(dá)，該基因與引起該小鼠不育表型的突變基因Nna1之間的關(guān)系，以及pcd小鼠睪丸中與精子發(fā)生相關(guān)基因和MAPK、NF-κB信號通路中關(guān)鍵因子的表達(dá)，進(jìn)而研究該基因在小鼠精子發(fā)生中的作用和分子機(jī)

4、制。
　　方法：第一部分1.運用RT-PCR和western blot方法檢測細(xì)胞和小鼠組織Usp9y基因表達(dá)的特異性；2.用Real-time PCR方法檢測不同日齡小鼠睪丸中Usp9y基因的表達(dá)差異性；第二部分1.用分子克隆方法構(gòu)建pEGFP-usp9y-(nt1558-1955)真核表達(dá)載體；2.通過磁珠轉(zhuǎn)染的方法將pEGFP-usp9y-(nt1558-1955)轉(zhuǎn)染到HEK293T細(xì)胞中，并通過熒光觀察和western

5、blot方法檢測其在真核細(xì)胞中的表達(dá)；3.通過磁珠轉(zhuǎn)染的方法將pEGFP-usp9y-(nt1558-1955)和pCMV-Myc-Nna1共轉(zhuǎn)染至HEK293T細(xì)胞中，用免疫共沉淀方法分析USP9Y蛋白和NNA1蛋白之間的相互作用；4.運用單分子表達(dá)譜方法研究pcd小鼠中Usp9y基因以及其他與精子發(fā)生相關(guān)基因和信號通路關(guān)鍵因子的表達(dá)。
　　結(jié)果：1.RT-PCR實驗證實Usp9y在小鼠睪丸組織中特異性表達(dá)，與以往報道的用Nor

6、thern blot檢測結(jié)果一致。2.熒光定量實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)18日齡的小鼠睪丸Usp9y表達(dá)升高。3.Usp9y在小鼠TM3睪丸間質(zhì)細(xì)胞和GC1spg精原細(xì)胞中表達(dá)，在15P-1支持細(xì)胞中未檢測到表達(dá)。4.成功構(gòu)建pEGFP-usp9y-(nt1558-1955)表達(dá)載體為后續(xù)實驗提供基礎(chǔ)。5.免疫共沉淀實驗發(fā)現(xiàn)Nna1的C端(nt1865-3780)與pEGFP-usp9y-(nt1558-1955)結(jié)構(gòu)域之間存在相互作用。6.單分子基

7、因表達(dá)譜分析發(fā)現(xiàn)pcd3J突變型小鼠睪丸組織中Nna1表達(dá)下調(diào)，Usp9y表達(dá)量明顯增高，該結(jié)果與以往基因芯片的結(jié)果一致。另外NF-κB信號通路中的Ikbkg、Ikbkb基因表達(dá)顯著上調(diào)。
　　結(jié)論：1.通過RT-PCR的方法確定Usp9y基因在小鼠睪丸間質(zhì)細(xì)胞及精原細(xì)胞內(nèi)表達(dá)；2.小鼠Usp9y基因在小鼠出生后18天表達(dá)明顯增高，說明Usp9y基因在精子發(fā)生早期可能具有顯著作用。3.USP9Y與NNA1可以形成免疫沉淀復(fù)合物,說