雙酚A對雄性小鼠生殖和睪丸GPER表達(dá)的影響及與腎虛不育的相關(guān)性研究.pdf

1、隨著工業(yè)化進(jìn)程的加劇，大量環(huán)境雌激素( Environmental estrogens, EEs)的釋放造成雄性生精功能障礙，因尚無行之有效防治方法，已引起國內(nèi)外生態(tài)學(xué)家及毒理學(xué)家的極大關(guān)注[1]。雙酚 A（Bisphenol-A, BPA）作為一類典型的EEs，是對男性生殖健康危害極大的一類環(huán)境污染物。
　　由于 BPA導(dǎo)致的雄性生殖障礙與腎虛不育不僅均出現(xiàn)精子生成的異常，還出現(xiàn)了相關(guān)的行為學(xué)改變，同時(shí)，補(bǔ)腎藥物能夠拮抗 BPA

2、引起的雄性生殖障礙的作用。我們的研究也表明[2]，腎陽虛不育大鼠不僅出現(xiàn)了精液質(zhì)量降低，還出現(xiàn)體質(zhì)量減輕、反應(yīng)遲鈍、弓背蜷縮、畏寒、體毛枯疏無光等改變，經(jīng)灌服金匱腎氣丸后，上述表現(xiàn)均有所改善。依據(jù)中醫(yī)“腎主生殖”與“方證相應(yīng)”的理論，我們推測 BPA引起的雄性生殖障礙可能屬于腎虛不育的范疇。
　　由于觀察動(dòng)物高架十字迷宮、曠場實(shí)驗(yàn)、游泳力竭時(shí)間等行為學(xué)改變，可反映其活動(dòng)量、驚恐狀態(tài)及耐力表現(xiàn)；且雄性動(dòng)物精液質(zhì)量及育仔數(shù)是判斷動(dòng)物生

3、育能力的最直觀指標(biāo)；另外，睪酮（Testosterone, T）、雌二醇( Estradiol, E2)和 T/E2水平異常與雄性不育關(guān)系密切[3]；同時(shí)，G蛋白偶聯(lián)雌激素受體(G protein coupled estrogen receptor, GPER)既能夠通過雌激素介導(dǎo)快速非基因組效應(yīng)，也能夠間接調(diào)控基因的轉(zhuǎn)錄活性，調(diào)控雄性生殖細(xì)胞增殖與分化[4]。
　　因此，我們將從行為學(xué)、雌雄激素水平及睪丸 GPER蛋白表達(dá)等方面

4、，對 BPA致雄性生殖障礙作用機(jī)制與腎虛不育的相關(guān)性進(jìn)行比較，以探討 BPA導(dǎo)致的生殖障礙是否屬于腎虛不育的范疇，不僅可為防治 BPA導(dǎo)致的雄性生殖障礙，而且可為男性不育的治療提供新的思路與策略。
　　第一部分：BPA與腎虛致生殖障礙小鼠的行為學(xué)改變
　　目的：
　　觀察實(shí)驗(yàn)小鼠行為學(xué)改變，探討B(tài)PA致雄性生殖障礙與腎虛不育的相關(guān)性。
　　方法：
　　1)將小鼠置于代謝籠中，監(jiān)測小鼠每日體重、睪丸重量、飲水

5、量和尿量變化。
　　2)采用高架十字迷宮裝置，通過計(jì)算機(jī)數(shù)字化采樣和分析技術(shù)檢測各組小鼠開臂進(jìn)入次數(shù)所占總進(jìn)入長臂的百分比以及開臂滯留時(shí)間所占總測試時(shí)間的百分比，評價(jià)小鼠驚恐和焦慮程度，以判斷其活動(dòng)度與驚恐程度。
　　3)采用曠場實(shí)驗(yàn)儀器，通過數(shù)據(jù)分析系統(tǒng)，自動(dòng)分析小鼠活動(dòng)度，檢測小鼠中央?yún)^(qū)進(jìn)入次數(shù)、中央?yún)^(qū)滯留時(shí)間百分比，評價(jià)小鼠活動(dòng)和焦慮程度，以判斷其活動(dòng)度與驚恐程度。
　　4)將小鼠置于長、寬為65cm×50cm長

6、方形水池中，水深50cm，采用負(fù)重游泳方式，于小鼠尾根部下3 cm處固定相當(dāng)于小鼠5％體質(zhì)量的鉛絲，使其自行游泳，以淹沒入水中5s并且連續(xù)3次者為游泳力竭表現(xiàn)，記錄各組小鼠力竭時(shí)間，評價(jià)小鼠的耐力。
　　結(jié)果：
　　1)與正常組相比，BPA組小鼠體質(zhì)量明顯減輕(P<0.05)，睪丸重量亦明顯減輕(P<0.01)。與BPA組相比，腎陽虛組小鼠體質(zhì)量無明顯變化(P>0.05)，睪丸重量雖有增加，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)

7、；腎陰虛組小鼠體質(zhì)量明顯減輕(P<0.01)，睪丸重量變化無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。
　　2)與正常組相比，BPA組與腎陽虛組小鼠飲水量于造模第5天開始，呈下降趨勢(P<0.05)，兩組小鼠尿量從第6天開始均顯著增加(P<0.05)，兩組之間無顯著性差異(P>0.05)。與 BPA組比較，腎陰虛組小鼠于造模第3天開始飲水量明顯增多(P<0.05)，尿量則無顯著性差異(P>0.05)。
　　3)與正常組相比，BPA組小鼠開

8、臂進(jìn)入次數(shù)和滯留時(shí)間百分比明顯減少(P<0.01)；與 BPA組相比，腎陽虛組小鼠開臂進(jìn)入次數(shù)和滯留時(shí)間百分比無明顯變化(P>0.05)，腎陰虛組小鼠開臂進(jìn)入次數(shù)百分比明顯增加(P<0.01)，而開臂滯留時(shí)間百分比無明顯變化(P>0.05)。
　　4)與正常組相比，BPA組小鼠中央?yún)^(qū)進(jìn)入次數(shù)減少(P<0.05)，中央?yún)^(qū)滯留時(shí)間百分比亦明顯減少(P<0.01)。與 BPA組相比，腎陽虛組小鼠中央?yún)^(qū)進(jìn)入次數(shù)顯著減少(P<0.05)，中

9、央?yún)^(qū)滯留時(shí)間百分比無明顯變化(P>0.05)；腎陰虛組小鼠中央?yún)^(qū)進(jìn)入次數(shù)明顯減少(P<0.01)，中央?yún)^(qū)滯留時(shí)間百分比顯著增加(P<0.05)。
　　5)與正常組相比，BPA組小鼠游泳力竭時(shí)間明顯縮短(P<0.01)。與 BPA組相比，腎陽虛組小鼠游泳力竭時(shí)間變化無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；而腎陰虛組小鼠游泳力竭時(shí)間顯著增加(P<0.05)。
　　6)與正常組相比，BPA組和腎陽虛組小鼠均出現(xiàn)了更為明顯的畏寒、蜷縮，毛發(fā)干

10、枯、無光澤、并出現(xiàn)稀疏脫落的現(xiàn)象，從水中撈出到毛發(fā)完全變干的時(shí)間也明顯延長，而腎陰虛組毛發(fā)干枯、無光澤、并出現(xiàn)稀疏脫落，但無明顯畏寒、蜷縮的表現(xiàn)。
　　結(jié)論：
　　BPA組與腎陽虛組小鼠體質(zhì)量、睪丸重量、飲水量及尿量等方面改變相似，而腎陰虛小鼠的體質(zhì)量下降更為顯著，飲水量也增加明顯，但尿量較前兩組減少。BPA組與腎陽虛組小鼠均出現(xiàn)驚恐狀態(tài)、活動(dòng)度減少及耐力下降，并伴毛發(fā)干枯、無光澤、并出現(xiàn)稀疏脫落等行為學(xué)表現(xiàn)；而腎陰虛組也出

11、現(xiàn)了驚恐狀態(tài)，活動(dòng)次數(shù)增多，雖耐力也下降，但較BPA組與腎陽虛組增加，并出現(xiàn)毛發(fā)干枯、無光澤、稀疏脫落等，但無明顯畏寒、蜷縮的表現(xiàn)。由此得出，BPA導(dǎo)致雄性小鼠生精障礙模型與腎陽虛不育模型更為相似。
　　第二部分：BPA與腎虛致生殖障礙小鼠精液質(zhì)量和雌雄激素水平的變化
　　目的：
　　檢測小鼠精子數(shù)量、精子活動(dòng)率和畸形精子百分率及血清T、E2及T/E2，探討B(tài)PA與腎虛誘導(dǎo)生殖障礙小鼠在精液質(zhì)量和雌雄激素水平的相關(guān)性。

12、
　　方法：
　　1)采用羅氏化學(xué)發(fā)光法檢測血清 T、E2、并計(jì)算 T/E2的比值。
　　2)將輸精管內(nèi)精液擠出，并將附睪尾剪碎，加入3ml生理鹽水，游離精子，制成精子懸液，在37℃水浴中孵育，使其充分液化。將精子懸液置于全自動(dòng)精子分析儀（SQAV）進(jìn)行分析，檢測精子計(jì)數(shù)、精子百分率、精子畸形率。
　　3）將各組雄性小鼠與發(fā)情期成年雌性小鼠同籠，雌雄比例為3:1，觀察檢測同雄鼠育仔數(shù)。
　　結(jié)果：
　

13、　1)與正常組相比，BPA組小鼠血清 T和T/E2比值明顯降低（P<0.01），E2變化無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05)。與 BPA組比較，腎陽虛組小鼠血清 T變化無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05)， E2略有降低，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05)，T/E2比值升高，(P<0.05)；腎陰虛組小鼠血清 T明顯升高(P<0.01)，E2及 T/E2比值均升高(P<0.05)。
　　2)與正常組相比，BPA組小鼠精子計(jì)數(shù)、活動(dòng)精子百分率明顯降低，

14、而精子畸形百分率增加(P<0.01)。與BPA組比較，腎陽虛組小鼠精子數(shù)量與精子畸形率變化無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，但活動(dòng)精子百分率增加(P<0.05)；腎陰虛組小鼠精子數(shù)量增加明顯(P<0.01)，活動(dòng)精子百分率顯著增加(P<0.05)，精子畸形率降低（P<0.05）。
　　3)與正常組相比，BPA組平均每只雄鼠與雌鼠育仔數(shù)為3.8只，且其中有4只雌鼠未懷孕(P<0.05)。與BPA組相比，腎陽虛組平均每只雄鼠與雌鼠育仔數(shù)為

15、4.33只，其中有4只雌鼠未懷孕，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；腎陰虛組平均每只雄鼠與雌鼠育仔數(shù)為6.46只，其中有4只雌鼠未懷孕(P<0.05)。
　　結(jié)論：
　　BPA組與腎陽虛組小鼠血清 T降低，而E2變化不顯，T/E2比值顯著下降；與BPA組相比，腎陰虛組小鼠T、E2及T/E2比值均增加；BPA組與腎陽虛組小鼠精子計(jì)數(shù)減少，精子畸形百分率增加，BPA組活動(dòng)精子百分率明顯低于腎陽虛組小鼠；而腎陰虛組小鼠精子數(shù)量、活

16、動(dòng)精子百分率及精子畸形率均增加。在育仔數(shù)方面， BPA組與腎陽虛組相近；腎陰虛組則較 BPA組增加。由此得出，BPA組與腎陽虛組在血清 T、E2和T/E2以及精子計(jì)數(shù)和精子畸形百分率具有相關(guān)性。
　　第三部分：GPER在BPA與腎虛致生殖障礙小鼠睪丸的表達(dá)
　　目的：
　　觀察睪丸GPER表達(dá)，探討B(tài)PA與腎虛致生精障礙小鼠發(fā)病機(jī)制的相關(guān)性。
　　方法：
　　1)采用 HE染色法，觀察睪丸結(jié)構(gòu)變化。

17、　　2)采用免疫組化染色（SABC）法，觀察睪丸 GPER的定位及表達(dá)。
　　3)采用免疫熒光染色法，觀察睪丸 GPER表達(dá)，并比較。
　　結(jié)果：
　　1)與正常組相比，BPA組、腎陰虛組和腎陽虛組小鼠睪丸曲細(xì)精管均呈不同程度的官腔壁受損、變薄，基膜連續(xù)性受到損壞，且生殖細(xì)胞呈雜亂無序排列，間質(zhì)細(xì)胞分布不均勻，生精上皮細(xì)胞層減少，腔內(nèi)精子數(shù)量減少。
　　2) GPER在小鼠睪丸間質(zhì)細(xì)胞有表達(dá)，其免疫反應(yīng)陽性物質(zhì)位

18、于間質(zhì)細(xì)胞的胞質(zhì)及胞膜內(nèi)，細(xì)胞核內(nèi)為陰性，在曲細(xì)精管內(nèi)的支持細(xì)胞及各級生精細(xì)胞均未見表達(dá)。
　　3)正常組小鼠睪丸 GPER呈陽性表達(dá)，熒光較弱，但可清楚可見（+）；BPA組GPER呈過高表達(dá)，熒光明亮，清晰可見（+++），與正常對照組相比有顯著差異(P<0.05)；腎陽虛組 GPER同樣呈過高表達(dá)，熒光明亮，清晰可見（+++），與BPA組相比無顯著性差異（P>0.05）；腎陰虛組 GPER表達(dá)下調(diào)，熒光較暗，但清晰可見（+），與

19、BPA組相比明顯減弱(P<0.05)。陰性對照無熒光表達(dá)（－）。
　　結(jié)論：
　　BPA組、腎陽虛組及腎陰虛組小鼠均出現(xiàn)了睪丸組織結(jié)構(gòu)均受損。GPER表達(dá)于睪丸間質(zhì)細(xì)胞質(zhì)及細(xì)胞膜上，腎陽虛組小鼠睪丸GPER表達(dá)明顯上調(diào)、清晰可見與BPA組相近，與BPA組相比，腎陰虛組小鼠睪丸GPER雖呈陽性，但表達(dá)量明顯下調(diào)。由此得出，BPA與腎陽虛導(dǎo)致的生精障礙小鼠睪丸間質(zhì)細(xì)胞 GPER表達(dá)上調(diào)，引起性激素水平紊亂，精子質(zhì)量下降，導(dǎo)致雄性