香煙煙霧對(duì)雄性小鼠生殖能力的影響及男性不育的相關(guān)生物信息學(xué)研究.pdf

1、目的:不孕不育影響了全世界近10％-15％的夫婦，已成為社會(huì)公共的健康問(wèn)題。其中，男性因素約占不孕癥病例的40％-50％，并且這個(gè)數(shù)字仍在不斷增加。幾十年來(lái)，香煙煙霧誘導(dǎo)男性不育的相關(guān)研究一直受到學(xué)者們的廣泛關(guān)注。然而，其確切的機(jī)制尚不明確。課題組前期通過(guò)構(gòu)建男性吸煙者與非吸煙者的450甲基化表達(dá)芯片，篩選出差異甲基化表達(dá)基因-外周致密纖維1(ODF1)，并通過(guò)焦磷酸測(cè)序進(jìn)一步證實(shí)了ODF1在吸煙者精子中的高甲基化表達(dá)。接下來(lái)，本研究將

2、通過(guò)體外模擬被動(dòng)吸煙環(huán)境，構(gòu)建吸煙小鼠模型，從精子發(fā)生水平探討香煙煙霧對(duì)成年雄性小鼠睪丸組織形態(tài)、精子活率、睪丸組織ODF1基因和蛋白表達(dá)的影響，從而探討香煙煙霧對(duì)雄性小鼠生殖能力影響的作用機(jī)理。此外，通過(guò)生物信息學(xué)分析，探討ODF1基因在男性不育樣本中的表達(dá)和進(jìn)一步分析男性不育差異基因的表達(dá)譜，探討男性不育的發(fā)生機(jī)理。
　　方法:
　　1、構(gòu)建吸煙小鼠模型:選取6-8周齡的C57BL/6J健康雄性小鼠，參照前人的研究方法體

3、外模擬被動(dòng)吸煙環(huán)境，分別給予小鼠香煙煙霧暴露處理2周、4周和6周，ELISA試劑盒檢測(cè)血清中可替寧的含量，驗(yàn)證吸煙小鼠模型的成功構(gòu)建。
　　2、實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證:(1) HE染色觀察吸煙小鼠睪丸組織形態(tài)的改變;(2)血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)小鼠精子活率;(3)免疫組織化學(xué)方法觀察吸煙小鼠睪丸組織ODF1蛋白改變情況;(4)實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)吸煙小鼠睪丸組織ODF1mRNA表達(dá)水平的改變。
　　3、生物信息學(xué)分析:(1)應(yīng)用GEO2R工

4、具對(duì)男性不育患者中ODF1基因進(jìn)行差異表達(dá)分析;(2)基于R/Bioconductor/DAVID進(jìn)行男性不育差異基因表達(dá)譜分析。
　　結(jié)果:
　　1、健康成年雄性小鼠經(jīng)過(guò)2周、4周和6周的香煙煙霧處理后，血清的可替寧含量明顯高于不吸煙組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。吸煙6周后，小鼠血清的可替寧含量己達(dá)吸煙者水平，為(10.76±2.19) ng/ml，提示吸煙小鼠模型的成功構(gòu)建;
　　2、香煙煙霧處理的小鼠睪丸組織生精上皮受

5、損，出現(xiàn)生精細(xì)胞的缺失及生殖細(xì)胞的凋亡;
　　3、香煙煙霧處理6周的小鼠睪丸組織ODF1mRNA表達(dá)量明顯低于對(duì)照組;
　　4、經(jīng)過(guò)香煙煙霧處理后，小鼠精子活率沒(méi)有發(fā)生顯著改變;
　　5、在“GSE6872”和“GSE45885”數(shù)據(jù)集中，相比正常生育男性，ODF1基因在畸形精子癥和非梗阻性無(wú)精子癥患者中為低表達(dá)狀態(tài)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)論:
　　1、本實(shí)驗(yàn)成功建立吸煙小鼠模型，可為后續(xù)的研究及其他疾