新基因TM4敲除小鼠模型的建立和表型觀察.pdf

1、第一部分 TM4基因敲除小鼠的繁育、鑒定和初步表型觀察
　　 目的：建立TM4基因敲除小鼠模型，并進(jìn)行初步表型觀察。
　　 方法：用基因誘捕(Gene trap)技術(shù)建立TM4基因敲除小鼠模型，采用PCR、Real-time PCR和Western blot的技術(shù)方法在DNA、mRNA水平和蛋白水平對(duì)模型的敲除效率進(jìn)行驗(yàn)證；并將所獲得的雄性雜合子小鼠與C57BL/6J雌性小鼠反復(fù)回交，純化基因背景，得到遺傳特性穩(wěn)定、基因

2、背景一致的小鼠種群。監(jiān)測(cè)小鼠每日飲食、每周體重變化，腹腔注射葡萄糖檢測(cè)小鼠糖耐量，同時(shí)檢測(cè)小鼠血壓；分離小鼠的腹主動(dòng)脈，在顯微鏡下迅速剝離腹主動(dòng)脈周圍脂肪、結(jié)締組織后，測(cè)定腹主動(dòng)脈環(huán)對(duì)苯腎上腺素和乙酰膽堿刺激的反應(yīng)性。
　　 結(jié)果：
　　 1.成功獲得TM4基因突變小鼠純合子模型，并在DNA水平鑒定證實(shí)基因誘捕載體成功插入TW4基因的內(nèi)含子中，Real-time PCR和Western blot結(jié)果驗(yàn)證純合子小鼠幾乎不表

3、達(dá)TM4基因和蛋白。
　　 2.純化種系已繁育鑒定至F11代。
　　 3.TM4敲除小鼠(純合子)收縮壓較同窩野生型對(duì)照顯著增加(119.34±3.19 vs102.33±6.16mmHg，p<0.05)，且敲除小鼠血管舒張功能下降(17.37％±7.38％vs36.7％±20.5％，p<0.05)。
　　 結(jié)論：已獲得基因背景一致的TM4基因敲除小鼠種群；小鼠缺失TM4基因后出現(xiàn)收縮壓升高，舒張功能下降。

4、>　　 第二部分高脂飲食下TM4敲除小鼠的表型觀察
　　 目的：觀察在高脂飲食誘導(dǎo)下，TM4敲除小鼠(純合子)的表型變化，闡明基因-環(huán)境共同作用對(duì)疾病發(fā)生發(fā)展的影響。
　　 方法：將4周齡大(剛斷母乳)的TM4敲除小鼠與同窩野生型對(duì)照小鼠(雌雄各5對(duì))，喂以高脂飼料。監(jiān)測(cè)小鼠每日飲食、每周體重變化，DEXA檢測(cè)小鼠身體組成成分，腹腔注射葡萄糖檢測(cè)小鼠糖耐量，檢測(cè)小鼠血壓，腹主動(dòng)脈環(huán)對(duì)苯腎上腺素和乙酰膽堿刺激的反應(yīng)性。高

5、脂喂養(yǎng)24周后，將小鼠麻醉處死，取血檢測(cè)血清因子；取各器官組織，稱重，甲醛固定石蠟包埋觀察組織病理變化，電鏡觀察各組織超微結(jié)構(gòu)。
　　 結(jié)果：
　　 1.高脂喂養(yǎng)后，TM4敲除雄性小鼠每日食物消耗量增加(5.24±0.66 vs3.42±0.38g，p<0.05)，體重明顯增加，在24周最明顯(53.2±8.61 vs38.7±6.22 g，p<0.05)，雌性小鼠食物消耗量和體重沒(méi)有明顯改變；
　　 2.DEX

6、A檢測(cè)結(jié)果顯示雄性TM4敲除小鼠體脂含量增加明顯(2.6±0.78 vs10.2±3.32％，p<0.05)；
　　 3.高脂喂養(yǎng)24周后麻醉解剖小鼠，可見(jiàn)雄性敲除小鼠腹腔白色脂肪堆積明顯，附睪脂肪、肝臟重量顯著增加；
　　 4.組織HE染色顯示雄性敲除小鼠脂肪體積增加，且有巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)；肝細(xì)胞內(nèi)有大量脂滴形成，是明顯脂肪肝表現(xiàn)；
　　 5.小鼠糖耐量受損；
　　 6.無(wú)論雌雄小鼠收縮壓均有明顯增加，且敲

7、除小鼠增加更為明顯(135.7±15.46vs114.8±10.21mmHg，p<0.05)，且敲除小鼠血管收縮、舒張功能下降。
　　 結(jié)論：高脂喂養(yǎng)后雄性TM4敲除出現(xiàn)明顯肥胖、脂肪肝、糖耐量受損、高血壓等代謝紊亂性表現(xiàn)。
　　 第三部分高脂飲食下TM4敲除小鼠出現(xiàn)代謝紊亂機(jī)制的初步探討
　　 目的：探討高脂飲食誘導(dǎo)下TM4敲除小鼠出現(xiàn)代謝紊亂的機(jī)制。
　　 方法：取高脂飲食喂養(yǎng)24周后雄性小鼠組織，抽

8、提組織RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，檢測(cè)小鼠基因譜的變化；抽提組織蛋白檢測(cè)蛋白因子表達(dá)變化；尋找差異表達(dá)基因和蛋白(表達(dá)差異在2倍以上)；根據(jù)相關(guān)芯片分析，用Western blotting方法驗(yàn)證小鼠肝臟、脂肪組織中Nur77-IKK-NF-κB信號(hào)通路蛋白表達(dá)水平。并用Realtime PCR檢測(cè)脂肪組織中脂質(zhì)代謝相關(guān)基因的表達(dá)變化。
　　 結(jié)果：
　　 1.高脂喂養(yǎng)后，雄性TM4敲除小鼠肝臟、脂肪組織中Nur77表達(dá)下調(diào)

9、，IKKβ和NF-κB的磷酸化水平增加；
　　 2.組織和血液中多種炎性因子表達(dá)增加；
　　 3.Real time PCR結(jié)果顯示脂肪組織中adiponectin表達(dá)明顯減少；而促進(jìn)抑制脂肪細(xì)胞生長(zhǎng)分化PPARa、PPARr、SREBP均明顯增加；而抑制脂肪細(xì)胞分化的Pref1表達(dá)明顯減少；促進(jìn)脂肪分解的HSL表達(dá)顯著上升；促進(jìn)脂肪酸合成的ACC1、SCD1、DGAT1明顯增加：而與脂肪酸β氧化相關(guān)的ACOX1顯著下降