新基因TM4功能的初步研究.pdf

1、目的:構(gòu)建TM4基因的真核表達(dá)載體,在HEK293細(xì)胞過(guò)表達(dá)TM4,觀察其對(duì)細(xì)胞增殖的影響。
　　 方法:以pDrive-TM4質(zhì)粒為模板,通過(guò)PCR擴(kuò)增出TM4基因的eDNA,將TM4基因克隆到真核表達(dá)載體PDC315及PDC315-GFP中,并用PCR、測(cè)序鑒定,進(jìn)一步用PDC315-TM4質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞以觀察TM4對(duì)細(xì)胞增殖的影響。
　　 結(jié)果:成功構(gòu)建TM4真核表達(dá)載體PDC315-TM4及PDC315

2、-GFP-TM4,經(jīng)測(cè)序鑒定序列正確,PDC315-TM4轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞72小時(shí)后,細(xì)胞增殖43％。
　　 結(jié)論:成功構(gòu)建了TM4真核表達(dá)載體,TM4具有促進(jìn)HEK293細(xì)胞增殖的作用。
　　 第二部分TM4基因突變小鼠模型的制備、繁育和鑒定
　　 目的:應(yīng)用基因誘捕(gene trap)技術(shù)建立TM4基因突變小鼠模型,并對(duì)模型進(jìn)行鑒定。
　　 方法:應(yīng)用基因誘捕方法制備TM4基因突變小鼠模型。用P

3、CR、Real-time PCR和Western-Blotting的方法在DNA、mRNA水平和蛋白水平進(jìn)行驗(yàn)證TM4基因的突變。同時(shí),選取毛色為黑色,性別為雄性的雜合子小鼠與C57小鼠進(jìn)行回交以純化基因背景。分別記為F1代,F2代,F3代,F4代。
　　 結(jié)果:成功獲得TM4基因突變小鼠純合子模型,并在DNA水平鑒定證實(shí)基因誘捕載體成功插入TM4基因的內(nèi)含子中,Real-time PCR半定量顯示野生型和純合子小鼠之間TM4在

4、mRNA水平表達(dá)顯著差異,并在蛋白水平顯示純合子幾乎不表達(dá)TM4蛋白。純化種系已繁育鑒定至F4代。
　　 結(jié)論:成功構(gòu)建了TM4基因突變小鼠模型。
　　 第三部分TM4基因突變小鼠表型的初步觀察
　　 目的:對(duì)TM4基因突變小鼠純合子進(jìn)行表型觀察。
　　 方法:分別測(cè)量純合子和野生型小鼠的空腹血糖、隨機(jī)血糖、饑餓狀態(tài)血糖;血壓;分離小鼠的腹主動(dòng)脈,在顯微鏡下剝離腹主動(dòng)脈周圍的脂肪、結(jié)締組織后測(cè)定腹主動(dòng)脈環(huán)

5、對(duì)苯腎上腺素和乙酰膽堿刺激的反應(yīng)性。
　　 結(jié)果:(1)血糖:TM4基因突變小鼠純合子組(n=8)的空腹血糖為5.54±1.49mmol/L,隨機(jī)血糖為7.56±1.08mmol/L,饑餓24小時(shí)后血糖為5.19±1.13;野生組(n=8)的空腹血糖為5.29±1.14mmol/L,隨機(jī)血糖為6.88±0.75mmol/L,饑餓24小時(shí)后血糖為5.04±0.72mmol/L,純合子組稍高于野生組(P＞0.05)。(2)血壓:TM

6、4基因突變小鼠純合子組(n=5)的收縮壓為127.14±4.45mmHg,舒張壓為98.50±10.21mmHg。野生組(n=4)的收縮壓為144.80±5.35mmHg,舒張壓為108.40±11.28mmHg。其中收縮壓純合子組顯著低于野生組,P=0.037,具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。(3)血管張力:KPSS刺激后兩組血管收縮無(wú)明顯差異。給予苯腎上腺素刺激后純合子組(n=3)張力增加9.71±1.26mN,野生組(n=5)張力增加8.82±1