正壬基酚及其同分異構(gòu)體對小鼠Sertoli TM4細胞的影響及其分子機制的研究.pdf

1、壬基酚（Nonylphenols，NPs）是一種環(huán)境毒性物質(zhì)和內(nèi)分泌干擾物，可對雄性生殖系統(tǒng)產(chǎn)生危害。事實上，壬基酚并不是單一的化合物，而是帶有一個苯環(huán)和九碳側(cè)鏈化合物的總稱，因此壬基酚存在多種同分異構(gòu)體。其中，九碳側(cè)鏈位于羥基對位的壬基酚被稱為對壬基酚或者是4-壬基酚，是最常見的壬基酚形式且是研究的重點對象，九碳側(cè)鏈為直鏈的4-NP稱為正-NP（4-n-NP）。壬基酚異構(gòu)體的生物效應(yīng)與其結(jié)構(gòu)具有一定的相關(guān)性，因此有必要研究單個壬基酚的

2、生物活性。環(huán)境內(nèi)分泌干擾物主要通過兩種機制發(fā)揮作用，一是通過激活細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路引起細胞的增殖或者凋亡；另一個是通過激素受體介導(dǎo)引起內(nèi)分泌干擾作用。本論文以正壬基酚（4-n-NP）以及12種4-NP異構(gòu)體單體為研究對象，以Sertoli TM4細胞為靶細胞，運用細胞和分子生物學(xué)技術(shù)，從細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路和內(nèi)分泌干擾兩個方面研究4-NP異構(gòu)體對TM4細胞的影響及其相關(guān)的分子機制，并通過比較差異探討4-NP異構(gòu)體的側(cè)鏈結(jié)構(gòu)與其活性的相關(guān)性。本

3、文主要研究內(nèi)容和結(jié)論歸納如下：
　　1.4-NP異構(gòu)體對Sertoli TM4細胞的細胞毒性作用
　　采用MTT法檢測細胞存活率以及流式檢測細胞凋亡，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在低濃度時，NP9、NP10以及 NP37促進 TM4細胞的生長，4-n-NP、NP65、NP70、NP111、NP112、NP143、NP152、NP194處理顯著誘導(dǎo)TM4細胞的凋亡，由此可見除4-n-NP外，壬基取代基主碳鏈長、取代基支鏈?。谆┑娜苫赢悩?gòu)體

4、可促進TM4細胞增殖；碳鏈越短、α-C位置取代基基團越大越復(fù)雜的壬基酚異構(gòu)體對Sertoli TM4細胞凋亡的誘導(dǎo)越強。4-NP異構(gòu)體主要是通過引起細胞氧化損傷以及與ROS生成相關(guān)的線粒體信號通路誘導(dǎo)細胞凋亡。在80-100μM時，所有4-NP異構(gòu)體通過直接毒性作用顯著降低TM4細胞的存活率。
　　2.4-NP異構(gòu)體對Sertoli TM4細胞內(nèi)鈣離子穩(wěn)態(tài)的影響
　　用4-NP異構(gòu)體處理細胞24h后檢測細胞內(nèi)鈣離子濃度變化及

5、引起其變化的相關(guān)機制。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，NP65、NP70、NP111、NP112、NP143、NP152、NP194暴露能夠上調(diào)TM4細胞內(nèi)鈣離子濃度，其中NP65、NP70、NP111、NP152作用顯著。4-NP異構(gòu)體對Sertoli TM4內(nèi)鈣離子的調(diào)控作用與Ca2+-ATPase活性，鈣泵功能，鈣離子通道激酶等因素有關(guān)?？梢娙苫尤〈鶑?fù)雜、體積大（具有乙基或丙基取代基）的異構(gòu)體易導(dǎo)致TM4細胞內(nèi)鈣離子濃度紊亂。
　　3.4-N

6、P異構(gòu)體對Sertoli TM4細胞內(nèi)MAPK、Akt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的影響
　　采用western blot的方法檢測了4-NP異構(gòu)體對細胞內(nèi)MAPK信號通路和Akt信號通路的影響。4-n-NP、NP41、NP42、NP65、NP111、NP112、NP143、NP152均能激活JNK信號通路；4-n-NP、NP111、NP112、NP143、NP152、NP194能夠激活p38信號通路；NP143、NP152、NP194對ERK信

7、號通路無影響，其他異構(gòu)體激活或抑制ERK通路。4-n-NP抑制Akt信號通路，其他所有檢測的NP異構(gòu)體能夠激活A(yù)kt信號通路。除4-n-NP外，壬基取代基大、α-C處取代基復(fù)雜的異構(gòu)體可激活JNK、p38信號通路，而對ERK信號通路無影響；碳鏈長、壬基取代基簡單的異構(gòu)體主要表現(xiàn)抑制JNK、p38信號通路。
　　4.4-NP異構(gòu)體對Sertoli TM4細胞激素受體和分泌功能的影響
　　4-n-NP能夠降低TM4細胞內(nèi)ER-β

8、的表達，下調(diào)細胞連接相關(guān)分子的表達，上調(diào)ABP的分泌，下調(diào)inhibin B的分泌，且能增加TM4細胞對IL-1α、TNF-α、TGF-β1等的分泌，降低TM4細胞對NO的分泌和iNOS的表達。12種4-NP異構(gòu)體對TM4細胞激素受體、連接相關(guān)分子的表達以及內(nèi)分泌功能均具有不同程度的影響，4-NP異構(gòu)體可通過激素受體、連接相關(guān)分子的表達以及內(nèi)分泌功能對TM4細胞產(chǎn)生損傷。
　　5.4-NP異構(gòu)體對Sertoli TM4細胞內(nèi)激素分

9、泌及其分子機制的研究
　　4-NP異構(gòu)體作用于細胞后，以PGE2為代表觀察4-NP異構(gòu)體對TM4細胞分泌激素的影響及其機制。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，4-n-NP、NP10、NP41、NP42、NP70暴露能夠誘導(dǎo)TM4細胞內(nèi)COX-2的表達和PGE2的釋放；NP9、NP37、NP65對TM4細胞內(nèi)PGE2的釋放無顯著影響；NP111、NP112、NP143、NP152、NP194可抑制TM4細胞對PGE2的釋放?？梢?，壬基取代基主鏈長（6-

10、7）且在β-C有取代基的異構(gòu)體刺激COX-2的表達和PGE2、IL-6的分泌；側(cè)鏈主鏈短（4-5）、在α-C處取代基比較大且復(fù)雜（乙基或丙基）的NP異構(gòu)體抑制TM4細胞分泌PGE2和IL-6。4-n-NP通過ROS誘導(dǎo)的NF-κB信號通路調(diào)節(jié)COX-2的表達和PGE2的釋放。
　　綜上所述，4-NP異構(gòu)體能夠通過細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路（包括線粒體細胞凋亡信號通路，鈣離子通道以及MAPK、Akt信號通路）和內(nèi)分泌干擾作用（包括對激素受體，