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1、壬基酚(4-n-Nonylphenol,4-n-NP)是生活中廣泛存在的環(huán)境激素,它們?cè)谧匀画h(huán)境中不易降解,具有較強(qiáng)的生物累積性,對(duì)于機(jī)體內(nèi)各臟器都具有損害作用,研究4-n-NP及其同分異構(gòu)體的生物學(xué)效應(yīng)已成為熱點(diǎn)。本文以體外培養(yǎng)的NCTC Clone1469小鼠肝細(xì)胞株作為毒理學(xué)模型,探討了4-n-NP對(duì)NCTC Clo ne1469細(xì)胞的毒性作用、氧化應(yīng)激作用、凋亡作用,以及壬基酚異構(gòu)體對(duì)NCTC Clone1469細(xì)胞膽汁酸分泌的
2、影響,為壬基酚及其異構(gòu)體的環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估提供理論依據(jù)。
首先,本論文探討了4-n-NP對(duì)NCTC Clone1469細(xì)胞的毒性作用,得出結(jié)果如下:(1)60、80、100μmol/L4-n-NP作用于NCTC Clone1469細(xì)胞可顯著抑制細(xì)胞生長(zhǎng),改變細(xì)胞形態(tài),并導(dǎo)致培養(yǎng)液中LDH、ALT、AST活性顯著升高;(2)4-n-NP(1-40μmol/L)可上調(diào)NCTC Clone1469細(xì)胞內(nèi)雌激素受體ERα、ERβmRNA及
3、蛋白表達(dá);(3)雌激素拮抗劑ICI182780無(wú)法減弱4-n-NP對(duì)NCTC Clone1469細(xì)胞的毒性作用。結(jié)果表明,4-n-NP可對(duì)NCTC Clone1469細(xì)胞產(chǎn)生毒性作用,并在一定濃度范圍內(nèi)可刺激細(xì)胞內(nèi)雌激素受體表達(dá),且兩者無(wú)關(guān)。
第二,本論文從抗氧化酶系統(tǒng)及過(guò)氧化產(chǎn)物兩方面綜合探討了4-n-NP對(duì)NCTC Clone1469細(xì)胞的氧化應(yīng)激作用,得出結(jié)果如下:(1)4-n-NP可使NCTC Clone1469細(xì)胞內(nèi)
4、ROS水平及MDA含量升高;(2)60μmol/L4-n-NP顯著降低NCTC Clone1469細(xì)胞內(nèi)SOD、CAT活性;(3)抗氧化劑NAC可顯著減弱4-n-NP對(duì)NCTC Clone1469細(xì)胞產(chǎn)生的毒性作用。由此結(jié)果推測(cè)4-n-NP對(duì)NCTC Clone1469細(xì)胞產(chǎn)生的毒性作用或與氧化應(yīng)激作用有關(guān)。
第三,本論文利用流式雙染法及免疫印跡法探討了4-n-NP對(duì)NCTC Clone1469細(xì)胞的凋亡作用及潛在機(jī)制,得出結(jié)
5、果如下:(1)4-n-NP可活化NCTC Clone1469細(xì)胞內(nèi)凋亡相關(guān)蛋白酶(Caspase-3、Caspase-12);(2)20-60μmol/L4-n-NP可上調(diào)NCTC Clone1469細(xì)胞內(nèi)促凋亡相關(guān)蛋白Bax的表達(dá),同時(shí)下調(diào)細(xì)胞內(nèi)抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá);(3)1-60μmol/L4-n-NP藥物組均可導(dǎo)致NCTC Clone1469細(xì)胞凋亡率及鈣離子水平升高且具有濃度依賴性;(4)Caspase-3抑制劑Z-DEV
6、D-FMK或Caspase-12抑制劑Z-ATAD-FMK均可抑制NCTC Clone1469細(xì)胞凋亡并降低細(xì)胞內(nèi)鈣離子水平。
最后,本論文通過(guò)酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)、反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)探究12種4-NP異構(gòu)體對(duì)NCTC Clone1469細(xì)胞總膽汁酸分泌量及膽汁酸代謝相關(guān)基因表達(dá)的影響,結(jié)果表明60μmol/L4-NP37、4-NP111、4-NP112、4-NP194可使NCTC Clone1469細(xì)胞總膽汁酸分泌量顯著升高,
7、并促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)雌激素受體ERα、膽汁酸代謝相關(guān)基因(CYP7A1、CYP27A1、C YP8B1)表達(dá),推測(cè)此4種壬基酚異構(gòu)體促使 NCTC Clone1469細(xì)胞總膽汁酸分泌量增加或與刺激ERα、CYP7A1、CYP27A1、CYP8B1 mRNA表達(dá)有關(guān)。
綜上所述,本研究明確了4-n-NP對(duì)NCTC Clone1469小鼠肝細(xì)胞所造成的損傷作用包括細(xì)胞毒性、氧化應(yīng)激及凋亡;4-NP異構(gòu)體可改變NCTC Clone1469小
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