MiR-142-5p高表達(dá)及抑制小鼠骨折模型建立及表型分析.pdf

1、第一部分 MiR-142-5p高表達(dá)或抑制轉(zhuǎn)基因小鼠模型的建立
　　目的:
　　建立miR-142-5p在骨組織內(nèi)特異性高表達(dá)及抑制的轉(zhuǎn)基因小鼠模型，以進(jìn)一步分析miR-142-5p在小鼠體內(nèi)對(duì)骨折愈合的影響。
　　方法:
　　(1)、首先合成pre-miR-142和miR-142-5p sponge序列，序列兩端包含SalⅠ和EcoRⅠ酶切位點(diǎn)，插入到本實(shí)驗(yàn)室保存的含骨鈣素啟動(dòng)子的表達(dá)質(zhì)粒(pOG2-Cre-h

2、GH)中，替換原質(zhì)粒的Cre序列。構(gòu)建好的質(zhì)粒分別命名為Bglap-pre-miR-142和Bglap-miR-142-S，經(jīng)測(cè)序及酶切后電泳驗(yàn)證;(2)在MC3T3-E1前成骨細(xì)胞株中分別轉(zhuǎn)染Bglap-pre-miR-142和Bglap-miR-142-S質(zhì)粒，使用含抗壞血酸及β-甘油磷酸鈉的培養(yǎng)液誘導(dǎo)成骨分化72h，使用PCR法檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)miR-142-5p表達(dá)水平變化;(3)將Bglap-pre-miR-142和Bglap-mi

3、R-142-S表達(dá)質(zhì)粒通過(guò)顯微注射的方法注射到C57BL/6小鼠的受精卵原核內(nèi)，待小鼠出生后3周使用PCR法鑒定表達(dá)質(zhì)粒已整合到小鼠基因組中;(4)使用PCR法檢測(cè)miR-142-5p和miR-142-5psponge轉(zhuǎn)基因小鼠不同組織內(nèi)的miR-142-5p表達(dá)，驗(yàn)證兩種小鼠是否存在骨組織特異性的miR-142-5p表達(dá)增加或降低。
　　結(jié)果:
　　1、成功構(gòu)建了含骨鈣素啟動(dòng)子的pre-miR-142-5p和miR-142

4、-5psponge表達(dá)質(zhì)粒，其能在MC3T3-E1細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化過(guò)程中表達(dá)，并導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)miR-142-5p增加或降低;
　　2、成功構(gòu)建了骨組織特異性表達(dá)的pre-miR-142-5p和miR-142-5p sponge轉(zhuǎn)基因小鼠，可導(dǎo)致骨組織特異性miR-142-5p表達(dá)增加或降低。
　　結(jié)論:
　　成功構(gòu)建了骨組織特異性miR-142-5p高表達(dá)或抑制的轉(zhuǎn)基因小鼠模型，為下一步體內(nèi)研究miR-142-5p在骨

5、折愈合過(guò)程中的作用奠定了基礎(chǔ)。
　　第二部分 MiR-142-5p高表達(dá)或抑制轉(zhuǎn)基因小鼠模型的骨折表型分析
　　目的:
　　研究體內(nèi)骨組織特異性miR-142-5p高表達(dá)或抑制對(duì)骨折愈合的影響，探討miR-142-5p在骨折愈合中的作用機(jī)制。
　　方法:
　　(1)、使用單側(cè)開(kāi)放性股骨干橫形骨切開(kāi)術(shù)并鎖釘內(nèi)固定法，在野生型、miR-142-5p骨組織特異性高表達(dá)型以及miR-142-5p骨組織特異性抑制型轉(zhuǎn)

6、基因小鼠中構(gòu)建骨折模型;(2)、使用X線(xiàn)攝片、組織切片HE染色檢測(cè)轉(zhuǎn)基因小鼠骨折后7d、14d、21d的骨折愈合情況，觀(guān)察miR-142-5p高表達(dá)或抑制對(duì)骨折愈合的影響;(3)、使用qRT-PCR法檢測(cè)轉(zhuǎn)基因小鼠骨折后0d、7d、14d、21d、28d的miR-142-5p及骨鈣素表達(dá)水平，觀(guān)察其表達(dá)模式;(4)、使用qRT-PCR及Western Blot法檢測(cè)轉(zhuǎn)基因小鼠骨折部位WWP1的表達(dá)，在體內(nèi)驗(yàn)證WWP1為miR-142-5

7、p的靶基因。
　　結(jié)果:
　　1、成功在野生型、miR-142-5p骨組織特異性高表達(dá)型及抑制型轉(zhuǎn)基因小鼠中構(gòu)建骨折模型。
　　2、X線(xiàn)攝片顯示，在miR-142-5p骨組織特異性高表達(dá)小鼠，骨折愈合速度較WT型明顯加快，而在miR-142-5p骨組織特異性抑制小鼠，骨折愈合速度較WT則明顯下降。
　　3、組織HE染色顯示，在miR-142-5p骨組織特異性高表達(dá)小鼠，骨痂的鈣化、編織骨的形成及塑形完成較WT明顯

8、增快，而在miR-142-5p骨組織特異性抑制小鼠，骨痂的鈣化、編織骨的形成較WT則明顯下降。
　　4、在WT小鼠，miR-142-5p及骨鈣素水平在骨折后21天達(dá)到高峰;而在miR-142-5p骨組織特異性高表達(dá)小鼠，miR-142-5p及骨鈣素水平表達(dá)增加且在骨折后14天即達(dá)到高峰;在miR-142-5p骨組織特異性抑制小鼠，miR-142-5p及骨鈣素水平較野生型顯著下降。
　　5、在小鼠中，骨折部位WWP1 mRNA

9、的表達(dá)水平隨著骨折后時(shí)間延長(zhǎng)均呈顯著上升趨勢(shì)，并在骨折后21天達(dá)到高峰，在miR-142-5p抑制型轉(zhuǎn)基因小鼠上升較WT小鼠更顯著。
　　結(jié)論:
　　miR-142-5p骨組織特異性高表達(dá)可以促進(jìn)骨折愈合，而miR-142-5p骨組織特異性抑制則延緩骨折愈合，miR-142-5p在動(dòng)物模型骨折愈合過(guò)程中仍然通過(guò)靶基因WWP1發(fā)揮作用。
　　第三部分MiR-142-5p對(duì)衰老小鼠骨折愈合的治療作用
　　目的:

10、>　　建立衰老小鼠骨折模型，觀(guān)察agomir-142-5p對(duì)衰老小鼠骨折愈合的治療作用。
　　方法:
　　(1)、在18月齡的C57BL/6小鼠中行單側(cè)股骨骨干橫形骨切開(kāi)術(shù)并鎖釘內(nèi)固定，構(gòu)建衰老小鼠骨折模型;(2)、使用qRT-PCR法檢測(cè)衰老小鼠骨折后0d、7d、14d、21d、28d的miR-142-5p及骨鈣素表達(dá)，觀(guān)察其表達(dá)模式;(3)、在骨折部位注射miR-142-5p擬似物agomir-142-5p，觀(guān)察衰老小鼠

11、骨折后28d的X線(xiàn)表現(xiàn);(4)、用組織HE染色法，觀(guān)察agomir-142-5p干預(yù)后衰老小鼠骨折后28d的骨折愈合情況。
　　結(jié)果:
　　1、成功構(gòu)建衰老小鼠骨折模型，并發(fā)現(xiàn)與年輕小鼠相比，衰老小鼠骨折后各個(gè)時(shí)期骨折部位miR-142-5p的表達(dá)均顯著降低。此外，衰老小鼠骨折后miR-142-5p的表達(dá)高峰延遲到骨折后28d。
　　2、在衰老小鼠，骨折后各個(gè)時(shí)期骨折部位骨鈣素的表達(dá)水平較年輕小鼠均顯著降低。
　

12、　3、骨折后28天，注射PBS或Agomir對(duì)照的衰老小鼠X線(xiàn)攝片仍可見(jiàn)模糊骨折線(xiàn)，骨痂量少，而在Agomir-142-5p注射的衰老小鼠，可見(jiàn)骨折線(xiàn)消失，骨痂較大，密度高。
　　4、在agomir-142-5p注射小鼠，28天時(shí)可見(jiàn)骨痂鈣化，部分連接成片，編織骨形成。而在agomir control及PBS注射小鼠，骨折后28天僅可見(jiàn)較多纖維性骨痂及軟骨性骨痂，部分鈣化。
　　結(jié)論:
　　Agomir-142-5p骨