miR-142-5p在動脈粥樣硬化斑塊中的表達及通過TGF-β2調控人巨噬細胞凋亡功能的作用.pdf

1、冠狀動脈粥樣硬化性心臟病(冠心病，coronaryheartdisease，CHD)近年的發(fā)病率和死亡率逐年上升，成為威脅人類健康的重大主要原因。動脈粥樣硬化是心血管疾病的一個主要的危險因素，近年研究表明microRNAs在動脈粥樣硬化斑塊的形成及發(fā)展過程中參與并起著重要的基因調控作用。動脈粥樣硬化和心血管疾病的進展中，microRNAs參與了包括內皮功能的變化、血管平滑肌細胞增殖和遷移、巨噬細胞的功能以及泡沫細胞的形成。巨噬細胞參與先

2、天免疫系統(tǒng)，幫助清除凋亡細胞和去除細胞碎片產生的組織重構和細胞壞死;巨噬細胞可以釋放炎性物質，影響動脈粥樣硬化。在冠心病的發(fā)生及發(fā)展過程中，炎癥起著重要的作用。研究發(fā)現microRNAs不但參與了炎癥細胞的發(fā)育、分化，還參與調控炎癥細胞的活化以及各種炎癥因子的相互作用。mir-142-5p目前在腫瘤、免疫疾病、淋巴組織及紅細胞胚胎干細胞方面都有研究，但在動脈粥樣硬化方面的研究尚未見報道。
　　 研究目的：
　　 (1)探

3、討mir-142-5p在動脈粥樣硬化斑塊中表達的變化;
　　 (2)進一步探討mir-142-5p在人巨噬細胞中的表達;
　　 (3)探討mir-142-5p的靶基因并觀察其對人巨噬細胞凋亡功能的影響。
　　 方法：
　　 1.1、動物模型的構建
　　 實驗選用8周齡的雄性ApoE-/-小鼠，在普食喂養(yǎng)3天后轉為高脂喂養(yǎng);2周后給予右側頸動脈套管術;給予套管高脂飲食8周，根據干預措施不同分為3組（

4、12只/組）:空白對照組;穩(wěn)定斑塊組;易損斑塊組。易損斑塊組給予限制性應激及噪音干預4周（前兩周4h/天，后2周6h/天，5天/周）后，行麻醉處死小鼠采集血樣、收集樣本入液氮罐中。
　　 1.2、microRNA芯片檢測
　　 將取材后的頸動脈血管在冰上清理后送康城生物公司進行microRNA芯片檢測，篩查在易損斑塊表達變化較明顯的microRNA，明確mir-142-5p在動脈粥樣硬化斑塊中的表達變化。
　　

5、1.3、觀察mir-142-5p在血管壁不同細胞中的表達，選擇變化明顯的細胞進一步研究
　　 在人平滑肌細胞、內皮細胞、巨噬細胞進行培養(yǎng)，用ox-LDL刺激，應用RT-PCR技術比較mir-142-5p在不同細胞中的表達變化。
　　 1.4、尋找mir-142-5p的靶基因
　　 通過數據庫及預測軟件預測mir-142-5p的靶基因:TGF-β2;通過脂質體2000將mir-142-5p的inhibitor及mi

6、mics轉染進入人巨噬細胞中，應用Western-bolt及RT-PCR技術對靶基因TGF-β2進行驗證。
　　 1.5、mir-142-5p及TGF-β2干預對人巨噬細胞凋亡功能的影響
　　 應用轉染技術將mir-142-5p的inhibitor、mimics及TGF-β2的inhibitor轉染進入人巨噬細胞中，通過AnnexinV-PE(AnnexinV-PEApoptosisDetectionKit)細胞凋亡檢測

7、試劑盒在激光共聚焦顯微鏡下觀察其對人巨噬細胞功能的影響。
　　 1.6、統(tǒng)計學分析
　　 兩組之間的差異比較采用獨立樣本t檢驗;多組之間差異的比較采用了方差分析(ANOVA)。以上結果應用了SPSS17.0軟件進行統(tǒng)計分析。以P＜0.05作為具有統(tǒng)計學意義。
　　 結果：
　　 2.1、mir-142-5p在斑塊中的表達
　　 MicroRNA芯片檢測結果顯示，mir-142-5p在穩(wěn)定斑塊組中的

8、表達比空白對照組高6.8倍;mir-142-5p在易損斑塊組中的表達比空白對照組高2.7倍。
　　 2.2、mir-142-5p在三種細胞中的表達
　　 培養(yǎng)人內皮細胞、平滑肌細胞及巨噬細胞，并用ox-LDL50ng/ml刺激24h后提取microRNA并應用RT-PCR技術檢測mir-142-5p在三種細胞中的表達，結果顯示內皮及平滑肌細胞中mir-142-5p的表達在對照組與ox-LDL干預組間差異均低于1.5倍（P

9、＞0.05），而mir-142-5p在巨噬細胞ox-LDL干預組中的表達高于對照組5.4倍（P＜0.05），與芯片結果趨勢符合。
　　 2.3、mir-142-5p的靶基因預測
　　 應用數據庫靶基因預測軟件預測mir-142-5p的靶基因可能為:TGF-β2;通過轉染技術將mir-142-5p的inhibitor及mimics轉染進入人巨噬細胞中，提取蛋白及RNA，Western-bolt及RT-PCR的結果均提示TG

10、F-1β2可能為mir-142-5p的靶基因。
　　 2.4、Mir-142-5p及TGF-β2干預對人巨噬細胞凋亡功能的影響
　　 control組細胞基本無凋亡;與control組比較，ox-LDL組細胞凋亡增加（凋亡細胞率:6.83+0.17％，P＜0.05）;mir-142-5pmimics+ox-LDL組（凋亡細胞率:5.27±0.19％）和TGF-β2inhibitor+mir-142-5pinhibitor

11、+ox-LDL組（凋亡細胞率:1.38±0.27％）及TGF-β2inhibitor+ox-LDL組（凋亡細胞率:2.74±0.21％）細胞凋亡也較ox-LDL組少(P＜0.05);與其它組比較mir-142-5pinhibitor+ox-LDL組凋亡細胞最多(凋亡細胞率:12.31+0.22％，P＜0.05)。凋亡細胞率=凋亡細胞數/總細胞數％。
　　 結論：
　　 1、mir142-5p在動脈粥樣硬化斑塊中表達上調。